Mémoire (M.Med.Exp.)-- Université du Québec à Chicoutimi, 1993. / Document électronique également accessible en format PDF. CaQCU

Introdução: Os lisossomos são organelas ácidas em que muitos tipos de macromoléculas, incluindo proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e lipídios são entregues para a degradação. A biogênese dos lisossomos requer a contínua substituição das enzimas lisossomais solúveis e das proteínas de membrana lisossomal. O direcionamento das hidrolases ácidas depende dos resíduos de manose-6-fosfato (M6P) que são reconhecidos por receptores específicos que medeiam o seu transporte para os lisossomos. O papel chave na formação destes resíduos é desempenhado no Complexo de Golgi pela enzima GlcNAc-1-fosfotransferase que contêm seis subunidades, α2β2γ2. Este complexo enzimático é codificado por dois genes, GNPTAB e GNPTG. Mutações nestes genes resultam em duas doenças lisossômicas, as mucolipidoses (ML) tipo II e III, caracterizadas bioquimicamente pela perda de múltiplas enzimas lisossomais, devido à formação deficiente dos resíduos de M6P. Objetivos: 1) Verificar a patogenicidade, por meio de ensaios in vitro, das seguintes mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II e III alfa/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G e c.3668_3670delCTA; 2) Caracterizar o perfil de mutações de GNPTG presente em uma amostra de pacientes com ML III gama; 3) Analisar o efeito de gentamicina e cloranfenicol sobre a atividade das enzimas α-manosidase, β-glicuronidase e β-galactosidase em fibroblastos de pacientes com ML III gama heterozigotos ou homozigotos para mutações sem sentido em GNPTG. Metodologia: Estudo transversal, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II/III. Mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II/III alfa/beta foram estudas em relação a expressão de mRNA, proteína, atividade enzimática e localização intracelular da GlcNAc-1-fosfotransferase. Pacientes também foram avaliados quanto a variações no gene GNPTG e seus possíveis impactos a nível de mRNA. O grupo de pacientes com ML III gama foram avaliados para medir sua independência funcional “Functional Independence Measure” (FIM). Estudos de expressão de GNPTAB e GNPTG também foram desenvolvidos para maior compreensão da relação destes genes. O desenvolvimento de um possível tratamento realizado nos fibroblastos de pacientes com ML III gama também foram objeto de estudo. Resultados: Mutações sem sentido e que alteram a fase de leitura da enzima GlcNAc-1-fosfotransferase não são corretamente transportados do retículo endoplasmático (RE) ao aparelho de Golgi, devido a interrupção, a falta dos sinais de exportação localizados nas porções N- e C- terminais da proteína. O não transporte ao Golgi e consequentemente, a ausência da clivagem proteolítica da proteína precursora das subunidades α/β, são responsáveis pela falta de atividade enzimática. Além dessas, mutações com sentido trocado na porção luminal da enzima também podem ter o transporte ao Golgi prejudicado, o que sugere a presença de um local de contato para uma proteína necessária para a exportação eficiente do RE. O estabelecimento de um ensaio radioativo para medir a atividade enzimática da GlcNAc-1-fosfotransferase confirmou que o transporte para o Golgi e a clivagem proteolítica nas subunidades α- e β- maduras é um pré-requisito para a atividade enzimática. As mutações em GNPTAB tiveram sua patogenicidade confirmada. Em relação a análise de GNPTG, as técnicas moleculares empregadas permitiram a identificação de três novas mutações patogênicas (c.244_247dupGAGT, c.328G>T e c.233+5G>C) e de uma outra variação (c.-112C>G). Após incessante investigação do trio cuja mutação causal c.244_247dupGAGT foi encontrada, a mesma foi atribuída como um evento de novo que ocorreu em um único óvulo ou de um mosaicismo germinativo no óvulo materno. Ao investigar o potencial efeito das mutações sem sentido através de mRNA, não foi possível identificar a mutação c.328G>T (p.E110X), no lugar desta, todos os pacientes apresentaram a sequência selvagem de GNPTG, evento denominado edição de RNA (c.328G@T). Porém, níveis de mRNA muito próximos a zero foram obtidos o que confirma a patogenicidade das mutações em GNPTG bem como o diagnóstico dos pacientes. Em pacientes ML II e III alfa/beta e em ML III gama, a redução dos níveis de mRNA de GNPTAB e GNPTG, respectivamente, pode ser facilmente explicada pela natureza das mutações identificadas nos pacientes. O que intriga, porém, é a expressão do gene não mutado. A divergência entre os resultados encontrados pode estar relacionada ao tipo de amostra, sabendo-se que as ML II e ML III são tecido-específicas. Fibroblastos de três pacientes com ML III gama portadores de mutações sem sentido foram tratados com geneticina e cloranfenicol. Este estudo de conceitos não demonstrou a possibilidade ou eficácia de um tratamento ser desenvolvido baseado na utilização de compostos não antibióticos atuarem sobre a tradução alternativa ou read through em pacientes com ML II e III. Conclusão: Estudos de caracterização genética, clínica e populacional sempre contribuirão para a elucidação dos mecanismos da doença e concomitantemente, melhor atendimento ao paciente. Com isto, é de grande importância que esforços e recursos sejam destinados a pesquisas nesta área para o completo entendimento das ML II e III e dos processos biológicos envolvidos. Este é o primeiro estudo brasileira a realizar o diagnóstico molecular de ML III gama; o primeiro a relatar uma mutação de novo e também, a ocorrência de edição de mRNA em pacientes com ML III gama. / Introduction: Lysosomes are acidic organelles into which many types of macromolecules including proteins, carbohydrates, nucleic acids and lipids are delivered for degradation. The biogenesis of lysosomes requires a continuous substitution of soluble lysosomal enzymes and lysosomal membrane proteins. The targeting of lysosomal enzymes depends on mannose 6-phosphate residues (M6P) that are recognized by M6P-specific receptors mediating their transport to lysosomes. The key role in the formation of M6P residues plays the Golgi-resident GlcNAc-1-phosphotransferase complex consisting of six subunits, α2β2γ2. This enzyme complex is encoded by two genes, GNPTAB and GNPTG. Mutations in these genes result in two lysosomal storage diseases, mucolipidosis (ML) type II and III, biochemically characterized by the missorting of multiple lysosomal enzymes due to impaired formation of M6P residues, and general lysosomal dysfunction. Objectives: 1)To analyze the pathogenicity, through in vitro tests, of GNPTAB mutations previously identified in Brazilian patients with ML II and III alpha/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G and c.3668_3670delCTA; 2) Characterize GNPTG mutational profile in a ML III gamma patients group; 3) Analyze the effect of gentamicin and chloramphenicol on the activity of α-mannosidase, β-glucuronidase and β-galactosidasein fibroblasts of ML III gamma patients with GNPTG nonsense mutations. Methods: Cross-sectional study, with convenience sample, including patients with a clinical and biochemical diagnosis of ML II/III. GNPTAB mutations previously identified in ML II/III alpha/beta Brazilian patients were studied in relation to mRNA and protein expression, enzyme activity and intracellular localization of GlcNAc-1-phosphotransferase. Patients were also evaluated to GNPTG variations and possible mRNA impacts. The ML III gamma patients group was also evaluated with the Functional Independence Measure (FIM). GNPTAB and GNPTG expression studies were developed to better understand the relationship between them. Geneticin and chloramphenicol were used to treat ML III gamma fibroblasts. Results: Nonsense and frameshift mutations of GlcNAc-1-phosphotransferase failed to reach the Golgi apparatus due to the interrupted cooperative ER export signals localized both in the N- and C-terminal cytosolic tails and lacked proteolytic activation of the α/β-subunit precursor. In addition, luminal missense mutations of the GlcNAc-1-phosphotransferase can also impair the transport to the Golgi apparatus, suggesting the presence of a protein contact site required for efficient ER export. The establishment of a radioactive assay to measure the activity of the GlcNAc-1-phosphotransferase confirmed that the transport to the Golgi and proteolytic cleavage into mature α- and β-subunits is prerequisite for enzymatic activity. Regarding GNPTG analysis, molecular techniques employed allowed the identification of three new pathogenic mutations (p.F83X, p.E110X, c.233+5G>C) and another variation (c.-112C>G). After research, p.F83X was attributable to a de novo event which occurred in only one ovum, or to germline mosaicism in the mothers’ ova. The potential effect of p.E110X mutation in mRNA was investigated. However it was not possible to identify transcripts carrying this mutation since all patients appear to present only the wild type sequence, an event called mRNA editing (c.328G@T). Nevertheless, low mRNA levels confirm the GNPTG mutations pathogenicity and the patients’ diagnosis. In ML II/III alpha/beta and ML III gamma patients, low GNPTAB and GNPTG mRNA expression levels, respectively, can easily be explained by the nature of the mutations. Interestingly, it is the non-mutated gene. Divergence between results may be related to the type of sample, given that ML II and III are tissue-specific diseases. Fibroblasts from three ML III gamma patients were treated with geneticin and chloramphenicol with no effect being observed. This pilot study does not support the feasibility or effectiveness for the development of a treatment based on the use of non-antibiotic compounds acting on the read through of either ML II or III patients. Conclusions: Genetic, clinical and population characterization studies always contribute to the elucidation of disease mechanisms and concomitantly, lead to better patient care. It is very important that efforts and resources to be focused in this area for the complete understanding of ML II and III as well as the biological processes involved. This is the first study to perform molecular diagnosis in ML III gamma Brazilian patients. Also it is the first to report a de novo mutation and the occurrence of mRNA editing in ML III gamma patients.

Introdução: Os lisossomos são organelas ácidas em que muitos tipos de macromoléculas, incluindo proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e lipídios são entregues para a degradação. A biogênese dos lisossomos requer a contínua substituição das enzimas lisossomais solúveis e das proteínas de membrana lisossomal. O direcionamento das hidrolases ácidas depende dos resíduos de manose-6-fosfato (M6P) que são reconhecidos por receptores específicos que medeiam o seu transporte para os lisossomos. O papel chave na formação destes resíduos é desempenhado no Complexo de Golgi pela enzima GlcNAc-1-fosfotransferase que contêm seis subunidades, α2β2γ2. Este complexo enzimático é codificado por dois genes, GNPTAB e GNPTG. Mutações nestes genes resultam em duas doenças lisossômicas, as mucolipidoses (ML) tipo II e III, caracterizadas bioquimicamente pela perda de múltiplas enzimas lisossomais, devido à formação deficiente dos resíduos de M6P. Objetivos: 1) Verificar a patogenicidade, por meio de ensaios in vitro, das seguintes mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II e III alfa/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G e c.3668_3670delCTA; 2) Caracterizar o perfil de mutações de GNPTG presente em uma amostra de pacientes com ML III gama; 3) Analisar o efeito de gentamicina e cloranfenicol sobre a atividade das enzimas α-manosidase, β-glicuronidase e β-galactosidase em fibroblastos de pacientes com ML III gama heterozigotos ou homozigotos para mutações sem sentido em GNPTG. Metodologia: Estudo transversal, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II/III. Mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II/III alfa/beta foram estudas em relação a expressão de mRNA, proteína, atividade enzimática e localização intracelular da GlcNAc-1-fosfotransferase. Pacientes também foram avaliados quanto a variações no gene GNPTG e seus possíveis impactos a nível de mRNA. O grupo de pacientes com ML III gama foram avaliados para medir sua independência funcional “Functional Independence Measure” (FIM). Estudos de expressão de GNPTAB e GNPTG também foram desenvolvidos para maior compreensão da relação destes genes. O desenvolvimento de um possível tratamento realizado nos fibroblastos de pacientes com ML III gama também foram objeto de estudo. Resultados: Mutações sem sentido e que alteram a fase de leitura da enzima GlcNAc-1-fosfotransferase não são corretamente transportados do retículo endoplasmático (RE) ao aparelho de Golgi, devido a interrupção, a falta dos sinais de exportação localizados nas porções N- e C- terminais da proteína. O não transporte ao Golgi e consequentemente, a ausência da clivagem proteolítica da proteína precursora das subunidades α/β, são responsáveis pela falta de atividade enzimática. Além dessas, mutações com sentido trocado na porção luminal da enzima também podem ter o transporte ao Golgi prejudicado, o que sugere a presença de um local de contato para uma proteína necessária para a exportação eficiente do RE. O estabelecimento de um ensaio radioativo para medir a atividade enzimática da GlcNAc-1-fosfotransferase confirmou que o transporte para o Golgi e a clivagem proteolítica nas subunidades α- e β- maduras é um pré-requisito para a atividade enzimática. As mutações em GNPTAB tiveram sua patogenicidade confirmada. Em relação a análise de GNPTG, as técnicas moleculares empregadas permitiram a identificação de três novas mutações patogênicas (c.244_247dupGAGT, c.328G>T e c.233+5G>C) e de uma outra variação (c.-112C>G). Após incessante investigação do trio cuja mutação causal c.244_247dupGAGT foi encontrada, a mesma foi atribuída como um evento de novo que ocorreu em um único óvulo ou de um mosaicismo germinativo no óvulo materno. Ao investigar o potencial efeito das mutações sem sentido através de mRNA, não foi possível identificar a mutação c.328G>T (p.E110X), no lugar desta, todos os pacientes apresentaram a sequência selvagem de GNPTG, evento denominado edição de RNA (c.328G@T). Porém, níveis de mRNA muito próximos a zero foram obtidos o que confirma a patogenicidade das mutações em GNPTG bem como o diagnóstico dos pacientes. Em pacientes ML II e III alfa/beta e em ML III gama, a redução dos níveis de mRNA de GNPTAB e GNPTG, respectivamente, pode ser facilmente explicada pela natureza das mutações identificadas nos pacientes. O que intriga, porém, é a expressão do gene não mutado. A divergência entre os resultados encontrados pode estar relacionada ao tipo de amostra, sabendo-se que as ML II e ML III são tecido-específicas. Fibroblastos de três pacientes com ML III gama portadores de mutações sem sentido foram tratados com geneticina e cloranfenicol. Este estudo de conceitos não demonstrou a possibilidade ou eficácia de um tratamento ser desenvolvido baseado na utilização de compostos não antibióticos atuarem sobre a tradução alternativa ou read through em pacientes com ML II e III. Conclusão: Estudos de caracterização genética, clínica e populacional sempre contribuirão para a elucidação dos mecanismos da doença e concomitantemente, melhor atendimento ao paciente. Com isto, é de grande importância que esforços e recursos sejam destinados a pesquisas nesta área para o completo entendimento das ML II e III e dos processos biológicos envolvidos. Este é o primeiro estudo brasileira a realizar o diagnóstico molecular de ML III gama; o primeiro a relatar uma mutação de novo e também, a ocorrência de edição de mRNA em pacientes com ML III gama. / Introduction: Lysosomes are acidic organelles into which many types of macromolecules including proteins, carbohydrates, nucleic acids and lipids are delivered for degradation. The biogenesis of lysosomes requires a continuous substitution of soluble lysosomal enzymes and lysosomal membrane proteins. The targeting of lysosomal enzymes depends on mannose 6-phosphate residues (M6P) that are recognized by M6P-specific receptors mediating their transport to lysosomes. The key role in the formation of M6P residues plays the Golgi-resident GlcNAc-1-phosphotransferase complex consisting of six subunits, α2β2γ2. This enzyme complex is encoded by two genes, GNPTAB and GNPTG. Mutations in these genes result in two lysosomal storage diseases, mucolipidosis (ML) type II and III, biochemically characterized by the missorting of multiple lysosomal enzymes due to impaired formation of M6P residues, and general lysosomal dysfunction. Objectives: 1)To analyze the pathogenicity, through in vitro tests, of GNPTAB mutations previously identified in Brazilian patients with ML II and III alpha/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G and c.3668_3670delCTA; 2) Characterize GNPTG mutational profile in a ML III gamma patients group; 3) Analyze the effect of gentamicin and chloramphenicol on the activity of α-mannosidase, β-glucuronidase and β-galactosidasein fibroblasts of ML III gamma patients with GNPTG nonsense mutations. Methods: Cross-sectional study, with convenience sample, including patients with a clinical and biochemical diagnosis of ML II/III. GNPTAB mutations previously identified in ML II/III alpha/beta Brazilian patients were studied in relation to mRNA and protein expression, enzyme activity and intracellular localization of GlcNAc-1-phosphotransferase. Patients were also evaluated to GNPTG variations and possible mRNA impacts. The ML III gamma patients group was also evaluated with the Functional Independence Measure (FIM). GNPTAB and GNPTG expression studies were developed to better understand the relationship between them. Geneticin and chloramphenicol were used to treat ML III gamma fibroblasts. Results: Nonsense and frameshift mutations of GlcNAc-1-phosphotransferase failed to reach the Golgi apparatus due to the interrupted cooperative ER export signals localized both in the N- and C-terminal cytosolic tails and lacked proteolytic activation of the α/β-subunit precursor. In addition, luminal missense mutations of the GlcNAc-1-phosphotransferase can also impair the transport to the Golgi apparatus, suggesting the presence of a protein contact site required for efficient ER export. The establishment of a radioactive assay to measure the activity of the GlcNAc-1-phosphotransferase confirmed that the transport to the Golgi and proteolytic cleavage into mature α- and β-subunits is prerequisite for enzymatic activity. Regarding GNPTG analysis, molecular techniques employed allowed the identification of three new pathogenic mutations (p.F83X, p.E110X, c.233+5G>C) and another variation (c.-112C>G). After research, p.F83X was attributable to a de novo event which occurred in only one ovum, or to germline mosaicism in the mothers’ ova. The potential effect of p.E110X mutation in mRNA was investigated. However it was not possible to identify transcripts carrying this mutation since all patients appear to present only the wild type sequence, an event called mRNA editing (c.328G@T). Nevertheless, low mRNA levels confirm the GNPTG mutations pathogenicity and the patients’ diagnosis. In ML II/III alpha/beta and ML III gamma patients, low GNPTAB and GNPTG mRNA expression levels, respectively, can easily be explained by the nature of the mutations. Interestingly, it is the non-mutated gene. Divergence between results may be related to the type of sample, given that ML II and III are tissue-specific diseases. Fibroblasts from three ML III gamma patients were treated with geneticin and chloramphenicol with no effect being observed. This pilot study does not support the feasibility or effectiveness for the development of a treatment based on the use of non-antibiotic compounds acting on the read through of either ML II or III patients. Conclusions: Genetic, clinical and population characterization studies always contribute to the elucidation of disease mechanisms and concomitantly, lead to better patient care. It is very important that efforts and resources to be focused in this area for the complete understanding of ML II and III as well as the biological processes involved. This is the first study to perform molecular diagnosis in ML III gamma Brazilian patients. Also it is the first to report a de novo mutation and the occurrence of mRNA editing in ML III gamma patients.

Introdução: Os lisossomos são organelas ácidas em que muitos tipos de macromoléculas, incluindo proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e lipídios são entregues para a degradação. A biogênese dos lisossomos requer a contínua substituição das enzimas lisossomais solúveis e das proteínas de membrana lisossomal. O direcionamento das hidrolases ácidas depende dos resíduos de manose-6-fosfato (M6P) que são reconhecidos por receptores específicos que medeiam o seu transporte para os lisossomos. O papel chave na formação destes resíduos é desempenhado no Complexo de Golgi pela enzima GlcNAc-1-fosfotransferase que contêm seis subunidades, α2β2γ2. Este complexo enzimático é codificado por dois genes, GNPTAB e GNPTG. Mutações nestes genes resultam em duas doenças lisossômicas, as mucolipidoses (ML) tipo II e III, caracterizadas bioquimicamente pela perda de múltiplas enzimas lisossomais, devido à formação deficiente dos resíduos de M6P. Objetivos: 1) Verificar a patogenicidade, por meio de ensaios in vitro, das seguintes mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II e III alfa/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G e c.3668_3670delCTA; 2) Caracterizar o perfil de mutações de GNPTG presente em uma amostra de pacientes com ML III gama; 3) Analisar o efeito de gentamicina e cloranfenicol sobre a atividade das enzimas α-manosidase, β-glicuronidase e β-galactosidase em fibroblastos de pacientes com ML III gama heterozigotos ou homozigotos para mutações sem sentido em GNPTG. Metodologia: Estudo transversal, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II/III. Mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II/III alfa/beta foram estudas em relação a expressão de mRNA, proteína, atividade enzimática e localização intracelular da GlcNAc-1-fosfotransferase. Pacientes também foram avaliados quanto a variações no gene GNPTG e seus possíveis impactos a nível de mRNA. O grupo de pacientes com ML III gama foram avaliados para medir sua independência funcional “Functional Independence Measure” (FIM). Estudos de expressão de GNPTAB e GNPTG também foram desenvolvidos para maior compreensão da relação destes genes. O desenvolvimento de um possível tratamento realizado nos fibroblastos de pacientes com ML III gama também foram objeto de estudo. Resultados: Mutações sem sentido e que alteram a fase de leitura da enzima GlcNAc-1-fosfotransferase não são corretamente transportados do retículo endoplasmático (RE) ao aparelho de Golgi, devido a interrupção, a falta dos sinais de exportação localizados nas porções N- e C- terminais da proteína. O não transporte ao Golgi e consequentemente, a ausência da clivagem proteolítica da proteína precursora das subunidades α/β, são responsáveis pela falta de atividade enzimática. Além dessas, mutações com sentido trocado na porção luminal da enzima também podem ter o transporte ao Golgi prejudicado, o que sugere a presença de um local de contato para uma proteína necessária para a exportação eficiente do RE. O estabelecimento de um ensaio radioativo para medir a atividade enzimática da GlcNAc-1-fosfotransferase confirmou que o transporte para o Golgi e a clivagem proteolítica nas subunidades α- e β- maduras é um pré-requisito para a atividade enzimática. As mutações em GNPTAB tiveram sua patogenicidade confirmada. Em relação a análise de GNPTG, as técnicas moleculares empregadas permitiram a identificação de três novas mutações patogênicas (c.244_247dupGAGT, c.328G>T e c.233+5G>C) e de uma outra variação (c.-112C>G). Após incessante investigação do trio cuja mutação causal c.244_247dupGAGT foi encontrada, a mesma foi atribuída como um evento de novo que ocorreu em um único óvulo ou de um mosaicismo germinativo no óvulo materno. Ao investigar o potencial efeito das mutações sem sentido através de mRNA, não foi possível identificar a mutação c.328G>T (p.E110X), no lugar desta, todos os pacientes apresentaram a sequência selvagem de GNPTG, evento denominado edição de RNA (c.328G@T). Porém, níveis de mRNA muito próximos a zero foram obtidos o que confirma a patogenicidade das mutações em GNPTG bem como o diagnóstico dos pacientes. Em pacientes ML II e III alfa/beta e em ML III gama, a redução dos níveis de mRNA de GNPTAB e GNPTG, respectivamente, pode ser facilmente explicada pela natureza das mutações identificadas nos pacientes. O que intriga, porém, é a expressão do gene não mutado. A divergência entre os resultados encontrados pode estar relacionada ao tipo de amostra, sabendo-se que as ML II e ML III são tecido-específicas. Fibroblastos de três pacientes com ML III gama portadores de mutações sem sentido foram tratados com geneticina e cloranfenicol. Este estudo de conceitos não demonstrou a possibilidade ou eficácia de um tratamento ser desenvolvido baseado na utilização de compostos não antibióticos atuarem sobre a tradução alternativa ou read through em pacientes com ML II e III. Conclusão: Estudos de caracterização genética, clínica e populacional sempre contribuirão para a elucidação dos mecanismos da doença e concomitantemente, melhor atendimento ao paciente. Com isto, é de grande importância que esforços e recursos sejam destinados a pesquisas nesta área para o completo entendimento das ML II e III e dos processos biológicos envolvidos. Este é o primeiro estudo brasileira a realizar o diagnóstico molecular de ML III gama; o primeiro a relatar uma mutação de novo e também, a ocorrência de edição de mRNA em pacientes com ML III gama. / Introduction: Lysosomes are acidic organelles into which many types of macromolecules including proteins, carbohydrates, nucleic acids and lipids are delivered for degradation. The biogenesis of lysosomes requires a continuous substitution of soluble lysosomal enzymes and lysosomal membrane proteins. The targeting of lysosomal enzymes depends on mannose 6-phosphate residues (M6P) that are recognized by M6P-specific receptors mediating their transport to lysosomes. The key role in the formation of M6P residues plays the Golgi-resident GlcNAc-1-phosphotransferase complex consisting of six subunits, α2β2γ2. This enzyme complex is encoded by two genes, GNPTAB and GNPTG. Mutations in these genes result in two lysosomal storage diseases, mucolipidosis (ML) type II and III, biochemically characterized by the missorting of multiple lysosomal enzymes due to impaired formation of M6P residues, and general lysosomal dysfunction. Objectives: 1)To analyze the pathogenicity, through in vitro tests, of GNPTAB mutations previously identified in Brazilian patients with ML II and III alpha/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G and c.3668_3670delCTA; 2) Characterize GNPTG mutational profile in a ML III gamma patients group; 3) Analyze the effect of gentamicin and chloramphenicol on the activity of α-mannosidase, β-glucuronidase and β-galactosidasein fibroblasts of ML III gamma patients with GNPTG nonsense mutations. Methods: Cross-sectional study, with convenience sample, including patients with a clinical and biochemical diagnosis of ML II/III. GNPTAB mutations previously identified in ML II/III alpha/beta Brazilian patients were studied in relation to mRNA and protein expression, enzyme activity and intracellular localization of GlcNAc-1-phosphotransferase. Patients were also evaluated to GNPTG variations and possible mRNA impacts. The ML III gamma patients group was also evaluated with the Functional Independence Measure (FIM). GNPTAB and GNPTG expression studies were developed to better understand the relationship between them. Geneticin and chloramphenicol were used to treat ML III gamma fibroblasts. Results: Nonsense and frameshift mutations of GlcNAc-1-phosphotransferase failed to reach the Golgi apparatus due to the interrupted cooperative ER export signals localized both in the N- and C-terminal cytosolic tails and lacked proteolytic activation of the α/β-subunit precursor. In addition, luminal missense mutations of the GlcNAc-1-phosphotransferase can also impair the transport to the Golgi apparatus, suggesting the presence of a protein contact site required for efficient ER export. The establishment of a radioactive assay to measure the activity of the GlcNAc-1-phosphotransferase confirmed that the transport to the Golgi and proteolytic cleavage into mature α- and β-subunits is prerequisite for enzymatic activity. Regarding GNPTG analysis, molecular techniques employed allowed the identification of three new pathogenic mutations (p.F83X, p.E110X, c.233+5G>C) and another variation (c.-112C>G). After research, p.F83X was attributable to a de novo event which occurred in only one ovum, or to germline mosaicism in the mothers’ ova. The potential effect of p.E110X mutation in mRNA was investigated. However it was not possible to identify transcripts carrying this mutation since all patients appear to present only the wild type sequence, an event called mRNA editing (c.328G@T). Nevertheless, low mRNA levels confirm the GNPTG mutations pathogenicity and the patients’ diagnosis. In ML II/III alpha/beta and ML III gamma patients, low GNPTAB and GNPTG mRNA expression levels, respectively, can easily be explained by the nature of the mutations. Interestingly, it is the non-mutated gene. Divergence between results may be related to the type of sample, given that ML II and III are tissue-specific diseases. Fibroblasts from three ML III gamma patients were treated with geneticin and chloramphenicol with no effect being observed. This pilot study does not support the feasibility or effectiveness for the development of a treatment based on the use of non-antibiotic compounds acting on the read through of either ML II or III patients. Conclusions: Genetic, clinical and population characterization studies always contribute to the elucidation of disease mechanisms and concomitantly, lead to better patient care. It is very important that efforts and resources to be focused in this area for the complete understanding of ML II and III as well as the biological processes involved. This is the first study to perform molecular diagnosis in ML III gamma Brazilian patients. Also it is the first to report a de novo mutation and the occurrence of mRNA editing in ML III gamma patients.

Introdução: As Mucolipidoses II e III (MLII e MLIII) são doenças lisossômicas raras causadas pela deficiência da GlcNac-1-fosfotransferase (fosfotransferase), enzima envolvida na síntese do marcador M6P responsável pelo direcionamento de várias enzimas lisossomais para o lisossomo. A fosfotransferase é codificada pelos genes GNPTAB e GNPTG. O gene GNPTAB codifica as subunidades e da enzima; mutações neste gene provocam tanto a MLII, forma mais grave, quanto a MLIII, forma mais atenuada da doença. O gene GNPTG codifica a subunidade ; mutações neste gene provocam a MLIII. Objetivos: Identificar as mutações no gene GNPTAB presentes em pacientes brasileiros com MLII e MLIII. Metodologia: Os pacientes com diagnóstico bioquímico de ML II/III foram identificados pelo Laboratório de Referência para EIM do HCPA (LREIM-HCPA), Brasil, de 1983 até 2009. Treze pacientes não relacionados (MLII:6, MLIII:5, ML tipo não definido: 2), filhos de casais não-consanguíneos, e oriundos de várias regiões do Brasil, foram incluídos no estudo. Informações clínicas foram obtidas a partir do banco de dados do LREIMHCPA, sendo que o tipo de ML e a altura foram fornecidos pelo médico assistente. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração de DNA genômico. Os 21 exons que compreendem o gene GNPTAB, e respectivas regiões flanqueadoras, foram amplificados a partir de sequências específicas de oligonucleotídeos projetadas para este trabalho. A sequência do gene GNPTAB utilizada como referência para o sequenciamento foi a GenBank NM_024312.3. Resultados: Com a estratégia utilizada, foi possível a identificação de ambas as mutações patogênicas em 6/13 pacientes, e de apenas uma mutação patogênica em cinco pacientes. Em dois pacientes, ambos com MLIII, não foram identificadas mutações patogênicas. Em todos os pacientes foi encontrada pelo menos uma variante não-patogênica, sendo a mais frequente a c.-41-39delGGC (16/26 alelos). A mutação c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) foi a mais frequente na amostra estudada (n= 7/26 alelos). Considerando regiões codificantes e não-codificantes, quatro novas mutações estão sendo descritas: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3) e c.365+96_97delGT (intron 4). Mutações sem sentido e deleções com alteração na fase de leitura parecem estar relacionadas ao fenótipo grave enquanto, mutações de sentido trocado, estão relacionadas ao fenótipo atenuado. Discussão/Conclusões: Este é o primeiro estudo do gênero realizado em pacientes brasileiros com MLII/III. Assim como é descrito em pacientes de outras populações, o gene GNPTAB apresentou grande heterogeneidade alélica e a mutação patogênica mais frequente encontrada foi a c.3503_3504delTC. Desta forma, sugere-se que a análise de DNA dos pacientes brasileiros com MLII/III seja iniciada pela pesquisa dessa mutação. Como a estratégia empregada detectou 17/26 dos alelos patogênicos, novas análises deverão ser realizadas para os pacientes que apresentam o genótipo parcialmente ou não estabelecido, incluindo a análise do GNPTG. Palavras-chaves: GNPTAB. Mucolipidose. Doenças Lisossômicas. M6P. Doença da Célula de Inclusão. Polidistrofia Pseudo-Hurler. / Introduction: Mucolipidosis II and III (MLII and MLIII) are rare lysosomal diseases caused by a deficiency of GlcNac-1-phosphotransferase (phosphotransferase), the enzyme responsible for the synthesis of marker M6P, which directs several lysosomal enzymes to the lysosome. Phosphotransferase is codified by the GNPTAB and the GNPTG genes. The GNPTAB gene codifies subunits and of the enzyme; mutations in this gene cause both MLII, the most severe form, and MLIII, the most attenuated form of the disease. The GNPTG gene codifies subunit ; mutations in this gene cause MLIII. Objectives: To identify mutations in the GNPTAB gene that are present in Brazilian patients with MLII and MLIII. Methodology: Patients with a biochemical diagnosis of ML II/III were identified at the Reference Laboratory of Inborn Errors of Metabolism of HCPA, Brazil, from 1983 to 2009. Thirteen unrelated patients (MLII: 6, MLIII: 5, undefined ML: 2), born to nonconsanguineous couples and from several regions of Brazil were included in the study. Clinical information was obtained from the database of the LREIM-HCPA, and the type of ML and height of patients were obtained with the assistant physician. Peripheral blood samples were collected for extraction of genomic DNA. The 21 exons that comprise the GNPTAB gene and their respective flanking regions were amplified from the specific sequences of primers designed for this study. The sequence of the GNPTAB gene used as reference for sequencing was GenBank NM_024312.3. Results: As a result of the strategy used, it was possible to identify both pathogenic mutations in 6/13 patients and only one pathogenic mutation in five patients. In two patients, both with MLIII, no pathogenic mutations were identified. At least one non-pathogenic variant was found in all patients, and the most frequently found was c.-41-39delGGC (16/26 alleles). Mutation c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) was the most frequently found pathogenic mutation in the sample studied (n= 7/26 alleles). As to codifying and noncodifying regions, four novel mutations are being described herein: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3), and c.365+96_97delGT (intron 4). Nonsense mutations and frameshift mutations seem to be related to the severe phenotype, while inverse mutations are related to the attenuated phenotype. Discussion/Conclusions: This is the first study of its kind conducted in Brazilian patients with ML II/III. As it is described in patients of other populations, the GNPTAB gene presented great allelic heterogeneity, and the most frequently found pathogenic mutation was c.3503_3504delTC. Thus, we suggest the DNA analysis of Brazilian patients with MLII/III to be initiated by testing this mutation. As the strategy applied herein detected 17/26 of the pathogenic alleles, new analyses should be conducted for the patients who present a partial or unestablished genotype, including the analysis of the GNPTG gene. Key words: GNPTAB. Mucolipidosis. Lysosomal Disease. M6P. I-cell Disease. Pseudo-Hurler Polydystrophy.

Introdução: As Mucolipidoses II e III (MLII e MLIII) são doenças lisossômicas raras causadas pela deficiência da GlcNac-1-fosfotransferase (fosfotransferase), enzima envolvida na síntese do marcador M6P responsável pelo direcionamento de várias enzimas lisossomais para o lisossomo. A fosfotransferase é codificada pelos genes GNPTAB e GNPTG. O gene GNPTAB codifica as subunidades e da enzima; mutações neste gene provocam tanto a MLII, forma mais grave, quanto a MLIII, forma mais atenuada da doença. O gene GNPTG codifica a subunidade ; mutações neste gene provocam a MLIII. Objetivos: Identificar as mutações no gene GNPTAB presentes em pacientes brasileiros com MLII e MLIII. Metodologia: Os pacientes com diagnóstico bioquímico de ML II/III foram identificados pelo Laboratório de Referência para EIM do HCPA (LREIM-HCPA), Brasil, de 1983 até 2009. Treze pacientes não relacionados (MLII:6, MLIII:5, ML tipo não definido: 2), filhos de casais não-consanguíneos, e oriundos de várias regiões do Brasil, foram incluídos no estudo. Informações clínicas foram obtidas a partir do banco de dados do LREIMHCPA, sendo que o tipo de ML e a altura foram fornecidos pelo médico assistente. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração de DNA genômico. Os 21 exons que compreendem o gene GNPTAB, e respectivas regiões flanqueadoras, foram amplificados a partir de sequências específicas de oligonucleotídeos projetadas para este trabalho. A sequência do gene GNPTAB utilizada como referência para o sequenciamento foi a GenBank NM_024312.3. Resultados: Com a estratégia utilizada, foi possível a identificação de ambas as mutações patogênicas em 6/13 pacientes, e de apenas uma mutação patogênica em cinco pacientes. Em dois pacientes, ambos com MLIII, não foram identificadas mutações patogênicas. Em todos os pacientes foi encontrada pelo menos uma variante não-patogênica, sendo a mais frequente a c.-41-39delGGC (16/26 alelos). A mutação c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) foi a mais frequente na amostra estudada (n= 7/26 alelos). Considerando regiões codificantes e não-codificantes, quatro novas mutações estão sendo descritas: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3) e c.365+96_97delGT (intron 4). Mutações sem sentido e deleções com alteração na fase de leitura parecem estar relacionadas ao fenótipo grave enquanto, mutações de sentido trocado, estão relacionadas ao fenótipo atenuado. Discussão/Conclusões: Este é o primeiro estudo do gênero realizado em pacientes brasileiros com MLII/III. Assim como é descrito em pacientes de outras populações, o gene GNPTAB apresentou grande heterogeneidade alélica e a mutação patogênica mais frequente encontrada foi a c.3503_3504delTC. Desta forma, sugere-se que a análise de DNA dos pacientes brasileiros com MLII/III seja iniciada pela pesquisa dessa mutação. Como a estratégia empregada detectou 17/26 dos alelos patogênicos, novas análises deverão ser realizadas para os pacientes que apresentam o genótipo parcialmente ou não estabelecido, incluindo a análise do GNPTG. Palavras-chaves: GNPTAB. Mucolipidose. Doenças Lisossômicas. M6P. Doença da Célula de Inclusão. Polidistrofia Pseudo-Hurler. / Introduction: Mucolipidosis II and III (MLII and MLIII) are rare lysosomal diseases caused by a deficiency of GlcNac-1-phosphotransferase (phosphotransferase), the enzyme responsible for the synthesis of marker M6P, which directs several lysosomal enzymes to the lysosome. Phosphotransferase is codified by the GNPTAB and the GNPTG genes. The GNPTAB gene codifies subunits and of the enzyme; mutations in this gene cause both MLII, the most severe form, and MLIII, the most attenuated form of the disease. The GNPTG gene codifies subunit ; mutations in this gene cause MLIII. Objectives: To identify mutations in the GNPTAB gene that are present in Brazilian patients with MLII and MLIII. Methodology: Patients with a biochemical diagnosis of ML II/III were identified at the Reference Laboratory of Inborn Errors of Metabolism of HCPA, Brazil, from 1983 to 2009. Thirteen unrelated patients (MLII: 6, MLIII: 5, undefined ML: 2), born to nonconsanguineous couples and from several regions of Brazil were included in the study. Clinical information was obtained from the database of the LREIM-HCPA, and the type of ML and height of patients were obtained with the assistant physician. Peripheral blood samples were collected for extraction of genomic DNA. The 21 exons that comprise the GNPTAB gene and their respective flanking regions were amplified from the specific sequences of primers designed for this study. The sequence of the GNPTAB gene used as reference for sequencing was GenBank NM_024312.3. Results: As a result of the strategy used, it was possible to identify both pathogenic mutations in 6/13 patients and only one pathogenic mutation in five patients. In two patients, both with MLIII, no pathogenic mutations were identified. At least one non-pathogenic variant was found in all patients, and the most frequently found was c.-41-39delGGC (16/26 alleles). Mutation c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) was the most frequently found pathogenic mutation in the sample studied (n= 7/26 alleles). As to codifying and noncodifying regions, four novel mutations are being described herein: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3), and c.365+96_97delGT (intron 4). Nonsense mutations and frameshift mutations seem to be related to the severe phenotype, while inverse mutations are related to the attenuated phenotype. Discussion/Conclusions: This is the first study of its kind conducted in Brazilian patients with ML II/III. As it is described in patients of other populations, the GNPTAB gene presented great allelic heterogeneity, and the most frequently found pathogenic mutation was c.3503_3504delTC. Thus, we suggest the DNA analysis of Brazilian patients with MLII/III to be initiated by testing this mutation. As the strategy applied herein detected 17/26 of the pathogenic alleles, new analyses should be conducted for the patients who present a partial or unestablished genotype, including the analysis of the GNPTG gene. Key words: GNPTAB. Mucolipidosis. Lysosomal Disease. M6P. I-cell Disease. Pseudo-Hurler Polydystrophy.

Introdução: As Mucolipidoses II e III (MLII e MLIII) são doenças lisossômicas raras causadas pela deficiência da GlcNac-1-fosfotransferase (fosfotransferase), enzima envolvida na síntese do marcador M6P responsável pelo direcionamento de várias enzimas lisossomais para o lisossomo. A fosfotransferase é codificada pelos genes GNPTAB e GNPTG. O gene GNPTAB codifica as subunidades e da enzima; mutações neste gene provocam tanto a MLII, forma mais grave, quanto a MLIII, forma mais atenuada da doença. O gene GNPTG codifica a subunidade ; mutações neste gene provocam a MLIII. Objetivos: Identificar as mutações no gene GNPTAB presentes em pacientes brasileiros com MLII e MLIII. Metodologia: Os pacientes com diagnóstico bioquímico de ML II/III foram identificados pelo Laboratório de Referência para EIM do HCPA (LREIM-HCPA), Brasil, de 1983 até 2009. Treze pacientes não relacionados (MLII:6, MLIII:5, ML tipo não definido: 2), filhos de casais não-consanguíneos, e oriundos de várias regiões do Brasil, foram incluídos no estudo. Informações clínicas foram obtidas a partir do banco de dados do LREIMHCPA, sendo que o tipo de ML e a altura foram fornecidos pelo médico assistente. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração de DNA genômico. Os 21 exons que compreendem o gene GNPTAB, e respectivas regiões flanqueadoras, foram amplificados a partir de sequências específicas de oligonucleotídeos projetadas para este trabalho. A sequência do gene GNPTAB utilizada como referência para o sequenciamento foi a GenBank NM_024312.3. Resultados: Com a estratégia utilizada, foi possível a identificação de ambas as mutações patogênicas em 6/13 pacientes, e de apenas uma mutação patogênica em cinco pacientes. Em dois pacientes, ambos com MLIII, não foram identificadas mutações patogênicas. Em todos os pacientes foi encontrada pelo menos uma variante não-patogênica, sendo a mais frequente a c.-41-39delGGC (16/26 alelos). A mutação c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) foi a mais frequente na amostra estudada (n= 7/26 alelos). Considerando regiões codificantes e não-codificantes, quatro novas mutações estão sendo descritas: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3) e c.365+96_97delGT (intron 4). Mutações sem sentido e deleções com alteração na fase de leitura parecem estar relacionadas ao fenótipo grave enquanto, mutações de sentido trocado, estão relacionadas ao fenótipo atenuado. Discussão/Conclusões: Este é o primeiro estudo do gênero realizado em pacientes brasileiros com MLII/III. Assim como é descrito em pacientes de outras populações, o gene GNPTAB apresentou grande heterogeneidade alélica e a mutação patogênica mais frequente encontrada foi a c.3503_3504delTC. Desta forma, sugere-se que a análise de DNA dos pacientes brasileiros com MLII/III seja iniciada pela pesquisa dessa mutação. Como a estratégia empregada detectou 17/26 dos alelos patogênicos, novas análises deverão ser realizadas para os pacientes que apresentam o genótipo parcialmente ou não estabelecido, incluindo a análise do GNPTG. Palavras-chaves: GNPTAB. Mucolipidose. Doenças Lisossômicas. M6P. Doença da Célula de Inclusão. Polidistrofia Pseudo-Hurler. / Introduction: Mucolipidosis II and III (MLII and MLIII) are rare lysosomal diseases caused by a deficiency of GlcNac-1-phosphotransferase (phosphotransferase), the enzyme responsible for the synthesis of marker M6P, which directs several lysosomal enzymes to the lysosome. Phosphotransferase is codified by the GNPTAB and the GNPTG genes. The GNPTAB gene codifies subunits and of the enzyme; mutations in this gene cause both MLII, the most severe form, and MLIII, the most attenuated form of the disease. The GNPTG gene codifies subunit ; mutations in this gene cause MLIII. Objectives: To identify mutations in the GNPTAB gene that are present in Brazilian patients with MLII and MLIII. Methodology: Patients with a biochemical diagnosis of ML II/III were identified at the Reference Laboratory of Inborn Errors of Metabolism of HCPA, Brazil, from 1983 to 2009. Thirteen unrelated patients (MLII: 6, MLIII: 5, undefined ML: 2), born to nonconsanguineous couples and from several regions of Brazil were included in the study. Clinical information was obtained from the database of the LREIM-HCPA, and the type of ML and height of patients were obtained with the assistant physician. Peripheral blood samples were collected for extraction of genomic DNA. The 21 exons that comprise the GNPTAB gene and their respective flanking regions were amplified from the specific sequences of primers designed for this study. The sequence of the GNPTAB gene used as reference for sequencing was GenBank NM_024312.3. Results: As a result of the strategy used, it was possible to identify both pathogenic mutations in 6/13 patients and only one pathogenic mutation in five patients. In two patients, both with MLIII, no pathogenic mutations were identified. At least one non-pathogenic variant was found in all patients, and the most frequently found was c.-41-39delGGC (16/26 alleles). Mutation c.3503_3504delTC (p.L1168QfsX5) was the most frequently found pathogenic mutation in the sample studied (n= 7/26 alleles). As to codifying and noncodifying regions, four novel mutations are being described herein: c.2269_2273delGAAAC (exon 13), c.2808A>G (exon 14), c.323+20delT (intron 3), and c.365+96_97delGT (intron 4). Nonsense mutations and frameshift mutations seem to be related to the severe phenotype, while inverse mutations are related to the attenuated phenotype. Discussion/Conclusions: This is the first study of its kind conducted in Brazilian patients with ML II/III. As it is described in patients of other populations, the GNPTAB gene presented great allelic heterogeneity, and the most frequently found pathogenic mutation was c.3503_3504delTC. Thus, we suggest the DNA analysis of Brazilian patients with MLII/III to be initiated by testing this mutation. As the strategy applied herein detected 17/26 of the pathogenic alleles, new analyses should be conducted for the patients who present a partial or unestablished genotype, including the analysis of the GNPTG gene. Key words: GNPTAB. Mucolipidosis. Lysosomal Disease. M6P. I-cell Disease. Pseudo-Hurler Polydystrophy.

Introdução: A rede lisossômica é um complexo de vias metabólicas que influenciam processos como degradação de organelas danificadas ou senescentes, processamento de antígenos, reutilização de aminoácidos essenciais e, em última instância, um sistema de fundamental importância para a fisiologia celular normal. Nesse contexto, os lisossomos possuem uma relevância muito grande, uma vez que é nessa organela que ocorre a destruição das moléculas envolvidas em todos os processos citados acima. Entre as unidades operacionais nos lisossomos estão as hidrolases lisossômicas, que são mais de 50 enzimas com capacidade, em ambiente ácido, de realizar a quebra de substratos específicos. A GlcNAc-fosfotransferase é um complexo hexamérico (J2K2L2) residente na porção cis do complexo de Golgi que realiza a adição de resíduos de manose-6- fosfato nas cadeias de oligossacarídeos das hidrolases lisossômicas. Com ação subsequente, a enzima descobridora realiza a remoção da manose, expõe os resíduos de fosfato e possibilita que as hidrolases sejam reconhecidas pelos receptores de manose-6- fosfato e direcionadas aos compartimentos lisossomais. As subunidades J e K da GlcNAc-fosfotransferase são codificadas pelo gene GNPTAB, localizado no cromossomo 12, constituído de 21 éxons, e a subunidade L pelo gene GNPTG, localizado no cromossomo 16, constituído de 11 éxons. Alterações patogênicas em GNPTAB podem causar as doenças Mucolipidose II ou III alfa/beta e alterações em GNPTG causam a doença Mucolipidose III gama. O defeito genético leva à atividade residual, ou nula, da enzima que acaba por gerar o extravasamento das hidrolases lisossômicas ao meio extracelular e o acúmulo de substratos nos lisossomos. Objetivos: (1) caracterizar as alterações patogênicas em GNPTAB em um grupo de pacientes brasileiros não relacionados com Mucolipidose II ou III alfa/beta, e (2) definir um protocolo de pesquisa molecular para os pacientes brasileiros. Metodologia: É um estudo transversal, com amostragem por conveniência, e inclui pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de Mucolipidose II ou III. Foi extraído DNA genômico dos pacientes a partir de sangue obtido por punção venosa periférica. O gene GNPTAB foi sequenciado através da técnica de Sanger. As alterações do tipo troca de sentido foram analisadas pelos programas de Bioinformática Polyphen2, Sift e Consurf, e as preditas como patogênicas foram pesquisadas em alelos controles brasileiros e analisadas por estudos funcionais, quando possível. A geração de construtos das alterações p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC foi realizada por mutagênese sítio-dirigida e a atividade residual destes foi avaliada 24 horas após expressão em células HEK. Para a análise financeira, valores atuais de equipamentos, reagente de biologia molecular e materiais plásticos foram utilizados para estimar o custo de uma extração de DNA, reação de PCR, purificação com PEG8000 e sequenciamento. Resultados: Foram incluídos 13 pacientes (ML II= 8; ML III= 5) e, adicionalmente, de uma mãe de paciente com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II. A análise molecular identificou seis alterações patogênicas novas, as c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly) e p.Try1111*. A análise de bioinformática das alterações do tipo troca de sentido as caracterizaram como prejudiciais para a função da proteína e os resíduos 76 e 385 como estrutural e funcional, respectivamente, além de ambos como altamente conservados entre as espécies. A análise funcional dos mutantes p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC identificaram atividades residuais de 1,5% e nula, respectivamente. Também foram identificadas outras seis alterações patogênicas previamente descritas. A alteração c.3503_3504delTC foi a que apresentou a maior frequência (40%, n= 10/25 alelos), seguido pela p.Ile403The (12%, n=3/25 alelos). Quanto às relações genótipo-fenótipo, sete pacientes com ML II possuem genótipos combinados de alterações do tipo mudança de fase de leitura e sem sentido, enquanto que os cincos pacientes com ML III alfa/beta apresentam pelo menos uma alteração do tipo troca de sentido, o que evidencia a relação entre alterações que impactam a funcionalidade da proteína e fenótipos mais graves. A análise retrospectiva definiu o protocolo 1.0 que finalizaria o diagnóstico com um custo médio de R$ 338,45, em uma amostra de 25 pacientes. A análise prospectiva do protocolo 2.0, sobre a mesma amostra de pacientes, indicou que o mesmo finalizaria o diagnóstico com o custo médio de R$ 299,80, uma economia de 25%. Discussão/Conclusão: As novas alterações patogênicas descritas nesse trabalho confirmam a alta heterogeneidade alélica do gene GNPTAB. A análise funcional da alteração p.Ser385Leu confirma sua patogenicidade, que está de acordo com o fenótipo ML II do paciente, e evidencia a necessidade de mais estudos a fim de constatar o motivo desse resíduo ser importante para a proteína. A síntese dos protocolos demonstrou ser uma estratégia interessante e economicamente importante, uma vez que diminui os gastos envolvidos para finalizar o diagnóstico molecular. / Introduction: The lysosomal network is a complex of metabolic ways that influence processes like damaged or senescent organelles degradation, antigen processing, essential amino acid reutilization, and, in the last instance, it is important for normal cell physiology. In this context, lysosomes have a great relevance since it is in this organelle that the destruction of the molecules involved in all the processes mentioned above occurs. The operational units in the lysosomes are the lysosomal hydrolases that are more than 50 enzymes with capacity, in an acid environment, to breakdown specific substrates. GlcNAc-phosphotransferase is a hexameric complex (J2K2L2) located in the cis portion of the Golgi complex that performs the addition of mannose-6-phosphate residues in oligosaccharides chains on lysosomal hydrolases. In a subsequent way, the uncovering enzyme removes the mannose residues, exposes the phosphate residues, and enables the recognition of hydrolases by mannose-6-phosphate receptors. The J and K subunits are codified by GNPTAB gene, which is located in chromosome 12 and consists of 21 exons, and the L subunit, encoded by GNPTG gene, that is located in chromosome 16 and consists of 11 exons. The consequences of pathogenic alterations in GNPTAB are Mucolipidosis II or III alpha/beta diseases and alterations in the GNPTG are Mucolipidosis III gamma disease. The genetic defect leads to residual or absent activity of enzyme which ultimately generates an overflow of lysosomal hydrolases to the extracellular environment and accumulation of substrates in lysosomes. Objectives: (1) to characterize, by sequencing of the GNPTAB gene, the pathogenic alterations in a group of unrelated Brazilian patients with Mucolipidosis II or III alpha/beta, and (2) to define a molecular research protocol for Brazilian patients. Methodology: It is a crosssectional study with convenience sampling, and it includes patients with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II or III. The DNA was amplified by PCR technique and sequencing by Sanger technique. All patients in the present study had all exons amplified. The missense alterations were analyzed by Polyphen2, Sift, and ConSurf softwares, and the alterations predicted as pathogenic were studied through research in Brazilian control alleles. The p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC were evaluated by site-direct mutagenesis and the residual activity was evaluated 24 hours after expression in HEK cells, through radioactive assays. For cost-price analysis, current values for equipment, molecular biology reagents, and plastic materials were utilized to estimate the cost of DNA extraction, PCR reaction, PEG8000 purification, and sequencing. Results: Of the 13 patients, 8 were clinically diagnosed with Mucolipidosis II and 5 with Mucolipidosis III alpha/beta and, additionally, a mother of one patient with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II was also analyzed. The DNA analysis identified six novel pathogenic alterations in GNPTAB: c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly), and p.Tyr1111*. The bioinformatics analysis of missense alterations were characterized as damaging for protein function, and residues 76 and 385 as structural and functional, respectively, and both as highly conserved among the species. The functional analysis of mutants p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC showed the residual activity of GlcNAcphosphotransferase of 1.5% and 0%, respectively. Six others pathogenic alterations previously described were also identified. The alteration c.3503_3504delTC showed the highest frequency (40%, n=10/25 alleles) followed by p.Ile403The (12%, n=3/25 alleles). The retrospective analysis defined the 1.0 protocol that finalized the molecular diagnosis at the cost of R$ 338,45 per sample, in a group of 25 patients. The prospective analysis of 2.0 protocol, in the same patients, indicated that it would finalize diagnosis at the cost of R$ 299,80 per sample, a saving of 25%. Discussion/Conclusion: The novel pathogenic alterations described confirm the high allelic heterogeneity of GNPTAB gene. In the genotype-phenotype relationship, 7 patients with Mucolipidosis II have combined genotype of frameshift or nonsense alterations, or both, and 5 Mucolipidosis III alpha/beta patients have at least one missense alteration, that shows the correlation between alterations that cause impact on the protein function and severe phenotype. The functional analysis of alteration p.Ser385Leu confirms its pathogenicity and makes evident the need of more studies in order to determine the reason this residue is so important for protein function. Protocol synthesis proves to be an interesting and economically important strategy, once it decreases costs to conclude the molecular diagnosis.

Introdução: A rede lisossômica é um complexo de vias metabólicas que influenciam processos como degradação de organelas danificadas ou senescentes, processamento de antígenos, reutilização de aminoácidos essenciais e, em última instância, um sistema de fundamental importância para a fisiologia celular normal. Nesse contexto, os lisossomos possuem uma relevância muito grande, uma vez que é nessa organela que ocorre a destruição das moléculas envolvidas em todos os processos citados acima. Entre as unidades operacionais nos lisossomos estão as hidrolases lisossômicas, que são mais de 50 enzimas com capacidade, em ambiente ácido, de realizar a quebra de substratos específicos. A GlcNAc-fosfotransferase é um complexo hexamérico (J2K2L2) residente na porção cis do complexo de Golgi que realiza a adição de resíduos de manose-6- fosfato nas cadeias de oligossacarídeos das hidrolases lisossômicas. Com ação subsequente, a enzima descobridora realiza a remoção da manose, expõe os resíduos de fosfato e possibilita que as hidrolases sejam reconhecidas pelos receptores de manose-6- fosfato e direcionadas aos compartimentos lisossomais. As subunidades J e K da GlcNAc-fosfotransferase são codificadas pelo gene GNPTAB, localizado no cromossomo 12, constituído de 21 éxons, e a subunidade L pelo gene GNPTG, localizado no cromossomo 16, constituído de 11 éxons. Alterações patogênicas em GNPTAB podem causar as doenças Mucolipidose II ou III alfa/beta e alterações em GNPTG causam a doença Mucolipidose III gama. O defeito genético leva à atividade residual, ou nula, da enzima que acaba por gerar o extravasamento das hidrolases lisossômicas ao meio extracelular e o acúmulo de substratos nos lisossomos. Objetivos: (1) caracterizar as alterações patogênicas em GNPTAB em um grupo de pacientes brasileiros não relacionados com Mucolipidose II ou III alfa/beta, e (2) definir um protocolo de pesquisa molecular para os pacientes brasileiros. Metodologia: É um estudo transversal, com amostragem por conveniência, e inclui pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de Mucolipidose II ou III. Foi extraído DNA genômico dos pacientes a partir de sangue obtido por punção venosa periférica. O gene GNPTAB foi sequenciado através da técnica de Sanger. As alterações do tipo troca de sentido foram analisadas pelos programas de Bioinformática Polyphen2, Sift e Consurf, e as preditas como patogênicas foram pesquisadas em alelos controles brasileiros e analisadas por estudos funcionais, quando possível. A geração de construtos das alterações p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC foi realizada por mutagênese sítio-dirigida e a atividade residual destes foi avaliada 24 horas após expressão em células HEK. Para a análise financeira, valores atuais de equipamentos, reagente de biologia molecular e materiais plásticos foram utilizados para estimar o custo de uma extração de DNA, reação de PCR, purificação com PEG8000 e sequenciamento. Resultados: Foram incluídos 13 pacientes (ML II= 8; ML III= 5) e, adicionalmente, de uma mãe de paciente com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II. A análise molecular identificou seis alterações patogênicas novas, as c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly) e p.Try1111*. A análise de bioinformática das alterações do tipo troca de sentido as caracterizaram como prejudiciais para a função da proteína e os resíduos 76 e 385 como estrutural e funcional, respectivamente, além de ambos como altamente conservados entre as espécies. A análise funcional dos mutantes p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC identificaram atividades residuais de 1,5% e nula, respectivamente. Também foram identificadas outras seis alterações patogênicas previamente descritas. A alteração c.3503_3504delTC foi a que apresentou a maior frequência (40%, n= 10/25 alelos), seguido pela p.Ile403The (12%, n=3/25 alelos). Quanto às relações genótipo-fenótipo, sete pacientes com ML II possuem genótipos combinados de alterações do tipo mudança de fase de leitura e sem sentido, enquanto que os cincos pacientes com ML III alfa/beta apresentam pelo menos uma alteração do tipo troca de sentido, o que evidencia a relação entre alterações que impactam a funcionalidade da proteína e fenótipos mais graves. A análise retrospectiva definiu o protocolo 1.0 que finalizaria o diagnóstico com um custo médio de R$ 338,45, em uma amostra de 25 pacientes. A análise prospectiva do protocolo 2.0, sobre a mesma amostra de pacientes, indicou que o mesmo finalizaria o diagnóstico com o custo médio de R$ 299,80, uma economia de 25%. Discussão/Conclusão: As novas alterações patogênicas descritas nesse trabalho confirmam a alta heterogeneidade alélica do gene GNPTAB. A análise funcional da alteração p.Ser385Leu confirma sua patogenicidade, que está de acordo com o fenótipo ML II do paciente, e evidencia a necessidade de mais estudos a fim de constatar o motivo desse resíduo ser importante para a proteína. A síntese dos protocolos demonstrou ser uma estratégia interessante e economicamente importante, uma vez que diminui os gastos envolvidos para finalizar o diagnóstico molecular. / Introduction: The lysosomal network is a complex of metabolic ways that influence processes like damaged or senescent organelles degradation, antigen processing, essential amino acid reutilization, and, in the last instance, it is important for normal cell physiology. In this context, lysosomes have a great relevance since it is in this organelle that the destruction of the molecules involved in all the processes mentioned above occurs. The operational units in the lysosomes are the lysosomal hydrolases that are more than 50 enzymes with capacity, in an acid environment, to breakdown specific substrates. GlcNAc-phosphotransferase is a hexameric complex (J2K2L2) located in the cis portion of the Golgi complex that performs the addition of mannose-6-phosphate residues in oligosaccharides chains on lysosomal hydrolases. In a subsequent way, the uncovering enzyme removes the mannose residues, exposes the phosphate residues, and enables the recognition of hydrolases by mannose-6-phosphate receptors. The J and K subunits are codified by GNPTAB gene, which is located in chromosome 12 and consists of 21 exons, and the L subunit, encoded by GNPTG gene, that is located in chromosome 16 and consists of 11 exons. The consequences of pathogenic alterations in GNPTAB are Mucolipidosis II or III alpha/beta diseases and alterations in the GNPTG are Mucolipidosis III gamma disease. The genetic defect leads to residual or absent activity of enzyme which ultimately generates an overflow of lysosomal hydrolases to the extracellular environment and accumulation of substrates in lysosomes. Objectives: (1) to characterize, by sequencing of the GNPTAB gene, the pathogenic alterations in a group of unrelated Brazilian patients with Mucolipidosis II or III alpha/beta, and (2) to define a molecular research protocol for Brazilian patients. Methodology: It is a crosssectional study with convenience sampling, and it includes patients with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II or III. The DNA was amplified by PCR technique and sequencing by Sanger technique. All patients in the present study had all exons amplified. The missense alterations were analyzed by Polyphen2, Sift, and ConSurf softwares, and the alterations predicted as pathogenic were studied through research in Brazilian control alleles. The p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC were evaluated by site-direct mutagenesis and the residual activity was evaluated 24 hours after expression in HEK cells, through radioactive assays. For cost-price analysis, current values for equipment, molecular biology reagents, and plastic materials were utilized to estimate the cost of DNA extraction, PCR reaction, PEG8000 purification, and sequencing. Results: Of the 13 patients, 8 were clinically diagnosed with Mucolipidosis II and 5 with Mucolipidosis III alpha/beta and, additionally, a mother of one patient with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II was also analyzed. The DNA analysis identified six novel pathogenic alterations in GNPTAB: c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly), and p.Tyr1111*. The bioinformatics analysis of missense alterations were characterized as damaging for protein function, and residues 76 and 385 as structural and functional, respectively, and both as highly conserved among the species. The functional analysis of mutants p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC showed the residual activity of GlcNAcphosphotransferase of 1.5% and 0%, respectively. Six others pathogenic alterations previously described were also identified. The alteration c.3503_3504delTC showed the highest frequency (40%, n=10/25 alleles) followed by p.Ile403The (12%, n=3/25 alleles). The retrospective analysis defined the 1.0 protocol that finalized the molecular diagnosis at the cost of R$ 338,45 per sample, in a group of 25 patients. The prospective analysis of 2.0 protocol, in the same patients, indicated that it would finalize diagnosis at the cost of R$ 299,80 per sample, a saving of 25%. Discussion/Conclusion: The novel pathogenic alterations described confirm the high allelic heterogeneity of GNPTAB gene. In the genotype-phenotype relationship, 7 patients with Mucolipidosis II have combined genotype of frameshift or nonsense alterations, or both, and 5 Mucolipidosis III alpha/beta patients have at least one missense alteration, that shows the correlation between alterations that cause impact on the protein function and severe phenotype. The functional analysis of alteration p.Ser385Leu confirms its pathogenicity and makes evident the need of more studies in order to determine the reason this residue is so important for protein function. Protocol synthesis proves to be an interesting and economically important strategy, once it decreases costs to conclude the molecular diagnosis.

Introdução: A rede lisossômica é um complexo de vias metabólicas que influenciam processos como degradação de organelas danificadas ou senescentes, processamento de antígenos, reutilização de aminoácidos essenciais e, em última instância, um sistema de fundamental importância para a fisiologia celular normal. Nesse contexto, os lisossomos possuem uma relevância muito grande, uma vez que é nessa organela que ocorre a destruição das moléculas envolvidas em todos os processos citados acima. Entre as unidades operacionais nos lisossomos estão as hidrolases lisossômicas, que são mais de 50 enzimas com capacidade, em ambiente ácido, de realizar a quebra de substratos específicos. A GlcNAc-fosfotransferase é um complexo hexamérico (J2K2L2) residente na porção cis do complexo de Golgi que realiza a adição de resíduos de manose-6- fosfato nas cadeias de oligossacarídeos das hidrolases lisossômicas. Com ação subsequente, a enzima descobridora realiza a remoção da manose, expõe os resíduos de fosfato e possibilita que as hidrolases sejam reconhecidas pelos receptores de manose-6- fosfato e direcionadas aos compartimentos lisossomais. As subunidades J e K da GlcNAc-fosfotransferase são codificadas pelo gene GNPTAB, localizado no cromossomo 12, constituído de 21 éxons, e a subunidade L pelo gene GNPTG, localizado no cromossomo 16, constituído de 11 éxons. Alterações patogênicas em GNPTAB podem causar as doenças Mucolipidose II ou III alfa/beta e alterações em GNPTG causam a doença Mucolipidose III gama. O defeito genético leva à atividade residual, ou nula, da enzima que acaba por gerar o extravasamento das hidrolases lisossômicas ao meio extracelular e o acúmulo de substratos nos lisossomos. Objetivos: (1) caracterizar as alterações patogênicas em GNPTAB em um grupo de pacientes brasileiros não relacionados com Mucolipidose II ou III alfa/beta, e (2) definir um protocolo de pesquisa molecular para os pacientes brasileiros. Metodologia: É um estudo transversal, com amostragem por conveniência, e inclui pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de Mucolipidose II ou III. Foi extraído DNA genômico dos pacientes a partir de sangue obtido por punção venosa periférica. O gene GNPTAB foi sequenciado através da técnica de Sanger. As alterações do tipo troca de sentido foram analisadas pelos programas de Bioinformática Polyphen2, Sift e Consurf, e as preditas como patogênicas foram pesquisadas em alelos controles brasileiros e analisadas por estudos funcionais, quando possível. A geração de construtos das alterações p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC foi realizada por mutagênese sítio-dirigida e a atividade residual destes foi avaliada 24 horas após expressão em células HEK. Para a análise financeira, valores atuais de equipamentos, reagente de biologia molecular e materiais plásticos foram utilizados para estimar o custo de uma extração de DNA, reação de PCR, purificação com PEG8000 e sequenciamento. Resultados: Foram incluídos 13 pacientes (ML II= 8; ML III= 5) e, adicionalmente, de uma mãe de paciente com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II. A análise molecular identificou seis alterações patogênicas novas, as c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly) e p.Try1111*. A análise de bioinformática das alterações do tipo troca de sentido as caracterizaram como prejudiciais para a função da proteína e os resíduos 76 e 385 como estrutural e funcional, respectivamente, além de ambos como altamente conservados entre as espécies. A análise funcional dos mutantes p.Ser385Leu e c.3503_3504delTC identificaram atividades residuais de 1,5% e nula, respectivamente. Também foram identificadas outras seis alterações patogênicas previamente descritas. A alteração c.3503_3504delTC foi a que apresentou a maior frequência (40%, n= 10/25 alelos), seguido pela p.Ile403The (12%, n=3/25 alelos). Quanto às relações genótipo-fenótipo, sete pacientes com ML II possuem genótipos combinados de alterações do tipo mudança de fase de leitura e sem sentido, enquanto que os cincos pacientes com ML III alfa/beta apresentam pelo menos uma alteração do tipo troca de sentido, o que evidencia a relação entre alterações que impactam a funcionalidade da proteína e fenótipos mais graves. A análise retrospectiva definiu o protocolo 1.0 que finalizaria o diagnóstico com um custo médio de R$ 338,45, em uma amostra de 25 pacientes. A análise prospectiva do protocolo 2.0, sobre a mesma amostra de pacientes, indicou que o mesmo finalizaria o diagnóstico com o custo médio de R$ 299,80, uma economia de 25%. Discussão/Conclusão: As novas alterações patogênicas descritas nesse trabalho confirmam a alta heterogeneidade alélica do gene GNPTAB. A análise funcional da alteração p.Ser385Leu confirma sua patogenicidade, que está de acordo com o fenótipo ML II do paciente, e evidencia a necessidade de mais estudos a fim de constatar o motivo desse resíduo ser importante para a proteína. A síntese dos protocolos demonstrou ser uma estratégia interessante e economicamente importante, uma vez que diminui os gastos envolvidos para finalizar o diagnóstico molecular. / Introduction: The lysosomal network is a complex of metabolic ways that influence processes like damaged or senescent organelles degradation, antigen processing, essential amino acid reutilization, and, in the last instance, it is important for normal cell physiology. In this context, lysosomes have a great relevance since it is in this organelle that the destruction of the molecules involved in all the processes mentioned above occurs. The operational units in the lysosomes are the lysosomal hydrolases that are more than 50 enzymes with capacity, in an acid environment, to breakdown specific substrates. GlcNAc-phosphotransferase is a hexameric complex (J2K2L2) located in the cis portion of the Golgi complex that performs the addition of mannose-6-phosphate residues in oligosaccharides chains on lysosomal hydrolases. In a subsequent way, the uncovering enzyme removes the mannose residues, exposes the phosphate residues, and enables the recognition of hydrolases by mannose-6-phosphate receptors. The J and K subunits are codified by GNPTAB gene, which is located in chromosome 12 and consists of 21 exons, and the L subunit, encoded by GNPTG gene, that is located in chromosome 16 and consists of 11 exons. The consequences of pathogenic alterations in GNPTAB are Mucolipidosis II or III alpha/beta diseases and alterations in the GNPTG are Mucolipidosis III gamma disease. The genetic defect leads to residual or absent activity of enzyme which ultimately generates an overflow of lysosomal hydrolases to the extracellular environment and accumulation of substrates in lysosomes. Objectives: (1) to characterize, by sequencing of the GNPTAB gene, the pathogenic alterations in a group of unrelated Brazilian patients with Mucolipidosis II or III alpha/beta, and (2) to define a molecular research protocol for Brazilian patients. Methodology: It is a crosssectional study with convenience sampling, and it includes patients with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II or III. The DNA was amplified by PCR technique and sequencing by Sanger technique. All patients in the present study had all exons amplified. The missense alterations were analyzed by Polyphen2, Sift, and ConSurf softwares, and the alterations predicted as pathogenic were studied through research in Brazilian control alleles. The p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC were evaluated by site-direct mutagenesis and the residual activity was evaluated 24 hours after expression in HEK cells, through radioactive assays. For cost-price analysis, current values for equipment, molecular biology reagents, and plastic materials were utilized to estimate the cost of DNA extraction, PCR reaction, PEG8000 purification, and sequencing. Results: Of the 13 patients, 8 were clinically diagnosed with Mucolipidosis II and 5 with Mucolipidosis III alpha/beta and, additionally, a mother of one patient with biochemical and clinical diagnosis of Mucolipidosis II was also analyzed. The DNA analysis identified six novel pathogenic alterations in GNPTAB: c.831delT, c.1763insA, c.1927delAATT, p.Ser385Leu, p.(Asp76Gly), and p.Tyr1111*. The bioinformatics analysis of missense alterations were characterized as damaging for protein function, and residues 76 and 385 as structural and functional, respectively, and both as highly conserved among the species. The functional analysis of mutants p.Ser385Leu and c.3503_3504delTC showed the residual activity of GlcNAcphosphotransferase of 1.5% and 0%, respectively. Six others pathogenic alterations previously described were also identified. The alteration c.3503_3504delTC showed the highest frequency (40%, n=10/25 alleles) followed by p.Ile403The (12%, n=3/25 alleles). The retrospective analysis defined the 1.0 protocol that finalized the molecular diagnosis at the cost of R$ 338,45 per sample, in a group of 25 patients. The prospective analysis of 2.0 protocol, in the same patients, indicated that it would finalize diagnosis at the cost of R$ 299,80 per sample, a saving of 25%. Discussion/Conclusion: The novel pathogenic alterations described confirm the high allelic heterogeneity of GNPTAB gene. In the genotype-phenotype relationship, 7 patients with Mucolipidosis II have combined genotype of frameshift or nonsense alterations, or both, and 5 Mucolipidosis III alpha/beta patients have at least one missense alteration, that shows the correlation between alterations that cause impact on the protein function and severe phenotype. The functional analysis of alteration p.Ser385Leu confirms its pathogenicity and makes evident the need of more studies in order to determine the reason this residue is so important for protein function. Protocol synthesis proves to be an interesting and economically important strategy, once it decreases costs to conclude the molecular diagnosis.