Cilia are small microtubule based protrusions found on most cells of the vertebrate body. In humans, defects in the structure or function of cilia results in a large class of developmental and homeostatic diseases known collectively as the ciliopathies. Ciliogenesis is accomplished by the concerted action of a number of molecular pathways including the intraflagellar transport (IFT) system. IFT is a group of ~20 highly conserved proteins that assemble into large macromolecular complexes known as trains. These trains act to carry cargo bi-directionally between the cell body and ciliary tip, via interaction with the microtubule motors kinesin and dynein. IFT train dynamics are required for both cilia structure and function, however the controls on these dynamics are still incompletely understood. Here, I present the first platform for study of IFT dynamics within vertebrate multiciliated cells, an understudied population with critical functions in development and homeostasis. Using this platform, I demonstrate that the planar cell polarity effector protein Fuz is required for IFT dynamics via its control of the cytoplasmic localization of a subset of IFT proteins. Subsequently, I find that a Fuz binding partner, the putative small GTPase Rsg1, is also required for IFT protein localization and dynamics. Additionally, I describe a role for Rsg1 in basal body docking, one of the earliest events of ciliogenesis. Finally, I show that the poorly studied protein TTC29 is required for a specific subset of IFT dynamic behaviors. These data reveal novel regulatory motifs for ciliogenesis and demonstrate, specifically, the complexities of IFT regulation in the cytoplasm and within the cilium itself. Finally, they suggest that multiciliated cells provide a tractable platform for generating robust datasets for the investigation ciliary dynamics. Such studies are critical for informing our understanding of the molecular etiology of human ciliopathic diseases. / text

Les cellules multiciliées jouent un rôle essentiel dans la propulsion des fluides physiologiques. Leur dysfonctionnement provoque des maladies chroniques. Contrairement à la plupart des cellules de mammifères qui possèdent un centrosome composé de deux centrioles, les cellules multiciliées possèdent une centaine de centrioles qui servent de base à la nucléation des cils motiles. Les mécanismes d'amplification de centrioles ou de régulation du nombre de centrioles dans ce type cellulaire étaient jusque-là inconnus. Les centrioles nouvellement formés étaient considérés comme apparaissant " de novo ". Une approche de vidéomicroscopie et de microscopie de super-résolution corrélative nous a d'abord permis de déterminer que tous les procentrioles sont générés à partir du centrosome préexistant. Nous démontrons que le centriole fils du centrosome est le site principal de nucléation de 95% de centrioles nouvellement formés dans les cellules multiciliées. Ces résultats réfutent par conséquent l'origine " de novo " des centrioles dans ce type cellulaire. Puis, nous montrons que la machinerie mitotique orchestre la progression spatio-temporelle de la dynamique centriolaire dans ces cellules post-mitotiques et en phase terminale de différentiation. L'amortissement de l'activité de Cdk1 empêche la rentrée en mitose tout en permettant la coordination du nombre de centrioles, leur croissance, et leur désengagement par des transitions phasiques nécessaires à la nucléation de cils motiles. Cette thèse aide à mieux comprendre la différentiation des cellules multiciliées, les ciliopathies, ainsi que l'amplification centriolaire pathologique associée avec le cancer et la microcéphalie. / Multiciliated mammalian cells play a crucial role in the propulsion of physiological fluids. Their dysfunction causes severe chronic diseases. In contrast to the strict centriole number control in cycling cells, multiciliated cell differentiation is marked by the production of up to several hundred centrioles, each nucleating a motile cilium. The mechanisms of centriole amplification or centriole number control in these cells were unknown and new centrioles were thought to appear de novo in the cytoplasm. First, videomicroscopy combined with correlative super-resolution and electron microscopy has enabled us to determine that all procentrioles are generated via runs of nucleation from the pre-existing progenitor cell centrosome. We show that the daughter centriole of the centrosome is the primary nucleation site for 95% of the new centrioles in multiciliated cells and thus refute the de novo hypothesis. Then, we provide evidence of an activation of the mitosis regulatory network during the centriole dynamic. With single cell live imaging and pharmacological modulation of mitosis regulators, we show that the mitosis machinery orchestrates the spatiotemporal progression of centriole amplification in terminally differentiating multiciliated cell progenitors. The fine-tuning of Cdk1 activity prevents mitosis while allowing the timely coordination of centriole number, growth, and disengagement through checkpoint-like phase transitions necessary for subsequent functional motile ciliation. This PhD provides a new paradigm for studying multiciliated cell differentiation, cilia-related diseases and pathological centriole amplification associated with cancer and microcephaly.

Chez les vertébrés, le battement coordonné des cils motiles présents par centaines à la surface apicale des cellules multiciliées (MCC) est requis pour propulser directionnellement les fluides biologiques à l’intérieur de certains organes (voies respiratoires, ventricules cérébraux, trompes utérines ou certaines structures embryonnaires). De nombreuses pathologies humaines sont associées à des défauts ciliaires ou à une perte des MCC (dyskinésies ciliaires, mucoviscidose, asthme,...). Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à élucider les mécanismes complexes contrôlant la différenciation des MCC et donc la formation des cils motiles (multiciliogenèse). Par des approches de génomiques fonctionnelles à partir de deux modèles d’épithéliums multiciliés évolutivement éloignés (épithélium respiratoire humain et épiderme d’embryon de Xénope) nous avons identifié la famille des microARN (petits ARN non-codants régulateurs de l’expression génique) miR-449 comme majoritairement exprimée dans les MCC. Nous avons montré que miR-449 contrôle la multiciliogenèse i) en bloquant le cycle cellulaire, ii) en réprimant directement la voie de signalisation Notch et iii) en inhibant l’expression de la petite GTPase R-Ras. Enfin, nos travaux montrent que l’ensemble de ces mécanismes est conservé chez les vertébrés. En conclusion, miR-449 est un nouveau régulateur clé de la multiciliogenèse conservé au cours de l’évolution. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des petits ARN régulateurs dans le traitement de certaines pathologies associées à des défauts ciliaires. / In vertebrates, the coordinated beating of hundreds of motile cilia present at the apical surface of multiciliated cells (MCC) is required for propel directionally flow of biological fluids inside some organs (airways, cerebral ventricles, fallopian tubes or some embryonic structures). Many human diseases are associated with ciliary defects or loss of MCC (ciliary dyskinesia, cystic fibrosis, asthma ...). In this context, my thesis has sought to elucidate the complex mechanisms that control the differentiation of MCC and thus the formation of motile cilia (multiciliogenesis). By functional genomic approaches from two evolutionarily distant models of multiciliated epithelia (human respiratory epithelium and epidermis of Xenopus embryo) we identified the miR-449 family of microRNAs (small non-coding RNAs regulating gene expression) as mainly expressed in MCC. Then, we showed that miR-449 controlled multiciliogenesis by i) blocking the cell cycle ii) directly suppressing the Notch pathway and iii) by inhibiting the expression of the small GTPase R-Ras. Finally, we have demonstrated that all these mechanisms were conserved in vertebrates. In conclusion, miR-449 is a new key and conserved regulator of multiciliogenesis. Our findings could pave the way for new therapeutic strategies using small regulatory RNAs in the treatment of several diseases associated with ciliary defects.