Tübingen, Univ., Diss., 2002.

Heidelberg, Universiẗat, Diss., 2005.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in engl. Sprache.

Die MP4-induzierte experimentelle autoimmune Encephalomyelitis (EAE) erlaubt eine fokussierte Betrachtung von B-Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) spielen. Es konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass das Vorhandensein von B-Zell-Aggregaten im zentralen Nervensystem (ZNS) von MS-Patienten mit einem aggravierten Krankheitsverlauf assoziiert war. Diese Follikel könnten dabei als ektope lymphatische Strukturen den Immunprozess aktiv gestalten und somit ein therapeutisches Ziel darstellen. In der vorliegenden Studie wurde der Effekt des Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor-Modulators Fingolimod (FTY720) auf die autoreaktive B-Zell-Antwort und speziell die Bildung von B-Zell-Aggregaten im Kleinhirn der MP4-EAE-Mäuse untersucht. / MP4-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a mouse model of multiple sclerosis (MS), which enables focused research on B cells, important protagonists in MS pathogenesis. This study is about the impact of the sphingosine-1-phosphate receptor modulator fingolimod (FTY720) on the autoreactive B cell response and the formation of B cell aggregates and lymphoid neogenesis in the murine central nervous system (CNS).

Im Zeitraum von 2004 bis 2016 erhielten an der Neurologischen Universitätsklinik Würzburg Patienten mit einer chronisch progredienten Multiplen Sklerose insgesamt 595 Injektionen von intrathekalem Triamcinolonacetonid. Diese Arbeit befasst sich mit Sicherheit, Nebenwirkungen und Wirksamkeit der intrathekalen Therapieform. / In the period from 2004 to 2016 patients with chronic progressive multiple sclerosis at the Neurological University Clinic Würzburg received a total of 595 injections of intrathecal triamcinolone acetonide. This work deals with safety, side effects and effectiveness of intrathecal therapy.

Da die Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) bis heute nicht vollständig geklärt ist, befassten wir uns mit der Rolle CEACAM1-exprimierender Immunzellen bei Patienten mit MS und untersuchten diese mittels durchflusszytometrischer Untersuchung. Bei CEACAM1 (Carcinoembryonic-antigen-related cell adhesion molecule) handelt es sich um ein Zelladhäsionsmolekül, das sowohl an inter- als auch intrazellulären Signalmechanismen modulatorisch beteiligt ist. Anhand unserer Ergebnisse scheint CEACAM1 keine zentrale Rolle in der Pathogenese der MS zu spielen. Es ließ sich jedoch eine signifikante Erhöhung CD56+dim NK-Zellen (natürliche Killerzellen) im peripheren Blut von Patienten mit schubförmig remittierender MS feststellen. Dies stützt die These, dass die „dim“-Subpopulation der NK-Zellen eine proinflammatorische Rolle in der Pathogenese der MS einnehmen könnte. Demnach sollte in Zukunft hinsichtlich der Entwicklung neuer Biomarker in der MS der Fokus auf NK-Zellen und Monozyten sowie deren Subpopulationen gerichtet werden. / Since the pathogenesis of multiple sclerosis (MS) is still not completely understood we examined the role of CEACAM1-expressing immune cells in patients with MS. CEACAM1 (carcinoembryonic-antigen-related cell adhesion molecule) can modulate inter- as well as intracellular interactions. By flow cytometric analysis we measured the frequency of different immune cells as well as the frequency of CEACAM1-expressing immune cells, mainly in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Our results suggest that CEACAM1-expressing immune cells do not play a major role in the pathogenesis of MS. Interestingly, the percentage of CD56+ dim natural killer cells (NK cells) was increased in patients with RRMS supporting the hypothesis that the „dim“ subpopulation of NK cells might contribute to the pathogenesis of MS in a proinflammatory way. Future studies should hence focus on examining the role of NK cells, monocytes and their subpopulations in MS aiming at finding possible new biomarkers.

Hintergrund - Die Multiple Sklerose (MS) ist bis heute eine nur teilweise verstandene Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Das Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) ermöglicht die Erforschung von Teilaspekten der Pathogenese der MS und kann zur Etablierung von Therapeutika herangezogen werden. Die MP4-abhängige EAE ermöglicht als Mausmodell die gezielte Erforschung der Rolle der B-Zelle als Akteur in der Pathogenese der MS. Diese Dissertation untersuchte den Effekt des S1P1-Rezeptor-Modulators FTY720 (Fingolimod) auf die Immunantwort der autoreaktiven B-Zellen in der Peripherie sowie im ZNS. Methoden - MP4-immunisierte Mäuse erhielten 50 Tage nach dem EAE-Krankheitsbeginn oral appliziertes FTY720 über einen Zeitraum von 30 Tagen. Die Tiere wurden nach dem Auftreten der Krankheitssymptome täglich klinisch evaluiert. Die MP4-spezifische B-Zell-Immunantwort und die MP4-spezifische humorale Immunreaktion wurden mittels ELISPOT und ELISA ausgewertet. Die Verteilung der T- und B-Zell-Anteile im peripheren Blut der Mäuse sowie die Aufteilung der B-Zell-Subsets in der Milz wurden mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Mittels Immunhistochemie wurden die B- und T-Zell-Ansammlungen im ZNS der Mäuse hinsichtlich ihrer Entwicklung in tertiär lymphatische Organe (TLOs) untersucht. Ergebnisse - In diesem Versuchsaufbau zeigte FTY720 keine signifikante Verbesserung des klinischen Krankheitsverlaufes der Tiere. Der Anteil von T-Zellen im peripheren Blut der Mäuse war unter der Therapie mit FTY720 signifikant reduziert, während die Anzahl an B-Zellen nicht-signifikant beeinflusst wurde. Bei der Untersuchung der B-Zell-Subtypen in der Milz fiel zunächst ein erhöhter Anteil an B220+-B-Zellen auf, während die Verteilung der weiteren Subsets nicht-signifikant verändert war. Unter der Therapie mit FTY720 zeigte sich keine Reduktion bereits etablierter B-Zell-Aggregate im ZNS, allerdings ist eine inhibierte Entwicklung in TLOs zu diskutieren. Zusammenfassung - Diese Arbeit impliziert unterschiedliche Effekte von FTY720 auf die B-Zellen in einem B-Zell-abhängigen chronischen Mausmodell der MS. / Background Multiple sclerosis (MS) has remained a partially understood autoimmune disease of the central nervous system (CNS). Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) triggered in animals is commonly used to study the pathogenesis of MS and to establish therapeutic agents. MP4-induced EAE represents a murine model of MS that allows targeted research on B cells, which have been a much-discussed protagonist in MS pathogenesis. This study investigates the effect of the S1P1 receptor modulator FTY720 (fingolimod) on the autoreactive B cell response as well as on the B cell distribution both in the periphery and the CNS. Methods Oral FTY720 application for a duration of 30 days was initiated in MP4-immunized mice 50 days after EAE onset. After immunization, clinical symptoms were monitored daily. The MP4-specific B cell and antibody response were studied using ELISPOT and ELISA. The distribution of peripheral B and T cells in the blood as well as B cell subsets in the spleen was evaluated by flow cytometry. The formation of B cell aggregates in the CNS and their development into tertiary lymphoid organs (TLOs) was studied by histology and immunohistochemistry. Results In this study, FTY720 did not significantly alter clinical EAE. Peripheral T cell numbers in the blood appeared to be significantly reduced after FTY720 treatment while the percentage of B cells were only slightly diminished. Evaluation of the B cell subsets in the spleen revealed a significantly higher percentage of B220+ B cells in FTY720-treated mice, whereas other B cell subtypes remained unaffected. Furthermore, there was no effect on already developed B cell aggregates in the CNS after FTY720 application, however treatment seemed to affect the evolution of B cell aggregates into TLOs. Conclusions This study implies differential effects of FTY720 treatment on the B cell compartment in a chronic B cell-dependent model of MS.

According to a widely held view, axon degeneration, neuron loss, and impaired clinical outcome are linked to demyelination in myelin diseases, like progressive multiple sclerosis. Our present study focused on understanding how demyelination, axon degeneration and clinical outcome are related to each other in the context of ongoing neuroinflammation. Two mouse models that carry mutations in the PLP1 gene, namely, PLP overexpressing mice (PLPtg) and mice carrying functional null mutations (PLPmut) were investigated at 6, 12, and 18 months of age. We used different microscopy techniques to visualize flat mounted retinae and optic nerve sections, as well as optic coherence tomography to investigate ongoing demyelination, axon degeneration and neuron loss in both mouse models. Our results showed that axon perturbation and neurodegeneration are more pronounced in PLPmut compared to PLPtg mice. On the contrary, microglia mediated demyelination was more pronounced in PLPtg mice. Additionally, we observed an increased deterioration of clinical outcome by rotarod performance in PLPmut in comparison to PLPtg mice. Thus, worsening of the clinical disease in both models was directly related to the degree of axon degeneration and, surprisingly, inversely related to myelin loss. Upon investigating immune cellular players involved in disease pathology, we observed a significant increase in the number of optic nerve-infiltrating CD8+ T cells, activated microglia, and upregulation of proinflammatory markers in both models. On the other hand, anti-inflammatory, and regeneration promoting markers were upregulated only in PLPtg mice. Based on the observation that CD8+ T cells drive myelinating oligodendrocyte to damage axons, we isolated and cultured oligodendrocyte precursor cells to probe for the cellular mechanism of axon damage in our models. We found that the cytotoxic T cell effector molecules, perforin and granzyme B, can induce cytoskeletal alterations within myelinating glial processes which might be related to the axon-damaging mechanism in vivo. Our study suggests that in myelin diseases, efficient demyelination might counteract neuroinflammation-mediated axon degeneration and allow resilience of axons at early stages of damage. These findings are of translational relevance for the use of neuroinflammation-modulating or remyelination-inducing agents in the management of myelin diseases. / Nach einer weit verbreiteten Ansicht sind Axondegeneration, Neuronenverlust und ein beeinträchtigtes klinisches Ergebnis mit Demyelinisierung bei Myelinerkrankungen wie progressiver Multipler Sklerose verbunden. Unsere vorliegende Studie konzentrierte sich darauf, zu verstehen, wie Demyelinisierung, Axondegeneration und klinische Ergebnisse im Kontext einer anhaltenden Neuroinflammation zusammenhängen. Zwei Mausmodelle, die Mutationen im PLP1-Gen tragen, nämlich PLP-überexprimierende Mäuse (PLPtg) und Mäuse mit funktionellen Nullmutationen (PLPmut), wurden im Alter von 6, 12 und 18 Monaten untersucht. Wir verwendeten verschiedene Mikroskopietechniken, um flach montierte Retinae und Sehnervenabschnitte zu visualisieren, sowie optische Kohärenztomographie, um die fortschreitende Demyelinisierung, Axondegeneration und den Neuronenverlust in beiden Mausmodellen zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Axonstörungen und Neurodegeneration bei PLPmut-Mäusen stärker ausgeprägt sind als bei PLPtg-Mäusen. Im Gegensatz dazu war die Mikroglia-vermittelte Demyelinisierung bei PLPtg-Mäusen ausgeprägter. Darüber hinaus beobachteten wir bei PLPmut im Vergleich zu PLPtg-Mäusen eine verstärkte Verschlechterung des klinischen Ergebnisses, wie wir durch die Rotarod-Analyse zeigen konnten. Somit stand die Verschlechterung der klinischen Erkrankung in beiden Modellen in direktem Zusammenhang mit dem Grad der Axon-Degeneration und überraschenderweise in umgekehrtem Zusammenhang mit dem Myelinverlust. Bei der Untersuchung von immunologischen Effektorzellen und -molekülen, die an der Krankheitsentwicklung beteiligt sind, beobachteten wir in beiden Modellen einen signifikanten Anstieg der Anzahl von CD8+-T-Zellen, die den Sehnerv infiltrieren, aktivierte Mikroglia und eine Hochregulierung von proinflammatorischen Markern. Andererseits wurden entzündungshemmende und regenerationsfördernde Marker nur in PLPtg-Mäusen hochreguliert. Basierend auf der Beobachtung, dass CD8+ T-Zellen myelinisierende Oligodendrozyten dazu bringen, Axone zu schädigen, isolierten und kultivierten wir Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, um den zellulären Mechanismus der Axonschädigung in unseren Modellen zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die zytotoxischen T-Zell-Effektormoleküle Perforin und Granzym B Zytoskelettveränderungen innerhalb myelinisierender Gliafortsätze induzieren können, die mit dem axonschädigenden Mechanismus in vivo zusammenhängen könnten. Unsere Studie legt nahe, dass bei Myelinerkrankungen eine effiziente Demyelinisierung der durch Neuroinflammation vermittelten Axondegeneration entgegenwirken und die Widerstandsfähigkeit von Axonen in frühen Stadien der Schädigung ermöglichen könnte. Diese Ergebnisse sind von translationaler Relevanz für die Verwendung von Neuroinflammations-modulierenden oder Remyelinisierung induzierenden Wirkstoffen bei der Behandlung von Myelinerkrankungen.

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Multiple Sklerose ist eine chronisch degenerative Erkrankung des ZNS, deren Therapie-möglichkeiten noch immer begrenzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro der selektive PDE-IV-Inhibitor Mesopram untersucht, welcher bereits in einer Phase II Studie bei Patienten mit klinisch gesicherter MS zum Einsatz kommt. Anhand von HBMEC’s, die als ein Model der menschlichen BHS gelten, konnten TJ’s (ZO-1, Claudin-3, Occludin), Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM, MCAM), Zytokine und Chemokine (AR, Il-6, MCP-1, Il-8) und MMP-2 nachgewiesen werden. Diese Faktoren sind bei der Zerstörung der BHS in der Pathologie der MS beteiligt. Die Idee dieser Arbeit war es, durch die spezifische PDE-IV-Inhibition mit Mesopram die untersuchten Faktoren der BHS so zu beeinflussen, dass eine weitere Permeabilitätserhöhung verhindert werden könnte. Da es sich bei MS um eine inflammatorische Erkrankung handelt und TNFα in MS-Läsionen gefunden wird, wurde in dieser Arbeit TNFα als inflammatorischer Stimulus verwendet. Unter TNFα-Stimulation wurden die meisten der genannten Faktoren vermehrt exprimiert. Keine Veränderung unter TNFα zeigten Occludin, ZO-1, VCAM und MMP-2. Die HBMEC’s wurden über 24 und 48 h mit TNFα und Mesopram stimuliert. Es konnte in den unterschiedlichen Auswertungen (ELISA, FACS, Western Blot, Zymographie) keine regulatorische Modulation der verschiedenen Faktoren unter Mesopram-induzierter cAMP-Erhöhung nachgewiesen werden. / Multiple Sklerose ist eine chronisch degenerative Erkrankung des ZNS, deren Therapie-möglichkeiten noch immer begrenzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro der selektive PDE-IV-Inhibitor Mesopram untersucht, welcher bereits in einer Phase II Studie bei Patienten mit klinisch gesicherter MS zum Einsatz kommt. Anhand von HBMEC’s, die als ein Model der menschlichen BHS gelten, konnten TJ’s (ZO-1, Claudin-3, Occludin), Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM, MCAM), Zytokine und Chemokine (AR, Il-6, MCP-1, Il-8) und MMP-2 nachgewiesen werden. Diese Faktoren sind bei der Zerstörung der BHS in der Pathologie der MS beteiligt. Die Idee dieser Arbeit war es, durch die spezifische PDE-IV-Inhibition mit Mesopram die untersuchten Faktoren der BHS so zu beeinflussen, dass eine weitere Permeabilitätserhöhung verhindert werden könnte. Da es sich bei MS um eine inflammatorische Erkrankung handelt und TNFα in MS-Läsionen gefunden wird, wurde in dieser Arbeit TNFα als inflammatorischer Stimulus verwendet. Unter TNFα-Stimulation wurden die meisten der genannten Faktoren vermehrt exprimiert. Keine Veränderung unter TNFα zeigten Occludin, ZO-1, VCAM und MMP-2. Die HBMEC’s wurden über 24 und 48 h mit TNFα und Mesopram stimuliert. Es konnte in den unterschiedlichen Auswertungen (ELISA, FACS, Western Blot, Zymographie) keine regulatorische Modulation der verschiedenen Faktoren unter Mesopram-induzierter cAMP-Erhöhung nachgewiesen werden.