This thesis presents the development and optimization of a high-throughput fluorescence microbead based approach for multiplexed, large scale medical diagnostics of biological fluids. Specifically, different sizes of semiconductor nanocrystals, called quantum dots, are infused into polystyrene microspheres, yielding a set of spectrally unique optical barcodes. The surface of these barcodes are then used for sandwich assays with target molecules and fluorophore-conjugated detection antibodies, changing the optical spectra of beads that have associated with (or captured) biomolecular targets. These assayed microbeads are analyzed at a single bead level in a high-throughput manner using an electrokinetic microfluidic system and laser induced fluorescence. Optical signals collected by solid state photodetectors are then processed using novel signal processing algorithms. This document will discuss developments made in each area of the platform as well as optimization of the platform for improved future performance.

This thesis presents the development and optimization of a high-throughput fluorescence microbead based approach for multiplexed, large scale medical diagnostics of biological fluids. Specifically, different sizes of semiconductor nanocrystals, called quantum dots, are infused into polystyrene microspheres, yielding a set of spectrally unique optical barcodes. The surface of these barcodes are then used for sandwich assays with target molecules and fluorophore-conjugated detection antibodies, changing the optical spectra of beads that have associated with (or captured) biomolecular targets. These assayed microbeads are analyzed at a single bead level in a high-throughput manner using an electrokinetic microfluidic system and laser induced fluorescence. Optical signals collected by solid state photodetectors are then processed using novel signal processing algorithms. This document will discuss developments made in each area of the platform as well as optimization of the platform for improved future performance.

No description available.

[ES] Los sistemas CRISPR-Cas se basan en un mecanismo del sistema inmune adaptativo que se encuentra en bacterias y arqueas. Funcionan utilizando endonucleasas guiadas por ARN (proteínas Cas) para localizar y reconocer secuencias específicas de ácidos nucleicos. Los sistemas CRISPR-Cas son revolucionarios en el campo de la ingeniería genética, permitiendo la edición específica del genoma, ensayos de regulación genética y, desarrolladas en los últimos años, aplicaciones de diagnóstico. Los métodos de detección de ácidos nucleicos son la técnica de diagnóstico de referencia en la clínica debido a su alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, de cara al futuro, debemos desarrollar métodos versátiles de detección de virus que permitan diagnósticos rápidos y fiables, que superen las limitaciones de las técnicas actuales y puedan usarse fácilmente fuera del laboratorio para aplicaciones en puntos de atención (POC). Los sistemas CRISPR-Cas se han reconvertido en herramientas de diagnóstico de ácidos nucleicos gracias a la capacidad de algunas proteínas Cas de realizar cortes colaterales no específicos al reconocer su diana. Nuestro objetivo es ampliar el conjunto de herramientas de diagnóstico CRISPR-Cas mediante el desarrollo de una nueva estrategia de detección de ácidos nucleicos basada en CRISPR-Cas9, cuyo modo de acción se basa en el desplazamiento de hebra en lugar de en la catálisis colateral. Demostramos que los amplicones de ADN del SARS-CoV-2 generados a partir de muestras de pacientes pueden detectarse con CRISPR-Cas9. También demostramos la capacidad de realizar la detección simultánea de diferentes amplicones de ADN con la misma nucleasa, ya sea para identificar diferentes regiones de SARS-CoV-2 o diferentes virus respiratorios. Para avanzar hacia aplicaciones POC, acoplamos el paso de preamplificación isotérmica con oligos biotinilados para producir amplicones marcados. Cuando se combina con CRISPR-Cas9 y sondas marcadas con FAM, esto permite la visualización colorimétrica de la detección mediante ensayos de flujo lateral (LFA) en tiras disponibles en el mercado. La lectura colorimétrica permite la interpretación de los resultados a simple vista, superando la necesidad de un fluorímetro. Detectamos con éxito SARS-CoV-2 a partir de muestras de pacientes en la configuración LFA, y cuando se combinó con RT-RPA multiplexado, se logró la detección de dos regiones distintas del virus en una sola prueba. Además, la ausencia de actividad colateral en nuestra metodología permite el procesamiento de secuencias posteriores adicionales. Por lo tanto, también pretendemos explorar la capacidad de integración de señales de nuestro método de detección basado en CRISPR-Cas9. Demostramos que diseños de circuitos lógicos de ADN pueden procesar diferentes señales de SARS-CoV-2 detectadas por los complejos CRISPR. También nos propusimos mejorar nuestro sistema CRISPR-Cas9 para detectar tanto proteínas como ácidos nucleicos. Nos propusimos diseñar un ARN guía condicional que respondiera a la presencia de la proteína spike del SARS-CoV-2. Para ello, insertamos un aptámero en el ARN guía para bloquear la actividad de Cas9 en ausencia de la proteína. En presencia de la proteína spike, la interacción aptámero-proteína hace que el motivo de bloqueo sufra un cambio conformacional, liberando el ARN guía y activando Cas9. Aunque logramos con éxito el escenario de bloqueo utilizando las secuencias reguladoras, es necesario seguir trabajando para identificar una secuencia que pueda inducir el cambio conformacional específico necesario para restaurar la actividad de Cas9 en presencia de la proteína spike. En conjunto, esta plataforma de diagnóstico CRISPR-Cas9 permite una detección multiplexada en un solo tubo, complementando los métodos existentes basados en CRISPR, y ofreciendo un sistema extensible para aplicaciones en diagnóstico en el punto de atención y biocomputación. / [CA] Els sistemes CRISPR-Cas es basen en un mecanisme del sistema immunitari adaptatiu que es troba en bacteris i arqueus. Funcionen utilitzant endonucleases guiades per ARN (proteïnes Cas) per tal de dirigir-se i reconéixer seqüències específiques d'àcids nucleics. Els sistemes CRISPR-Cas siguen revolucionaris en el camp de l'enginyeria genètica, permetent l'edició específica del genoma, assajos de regulació gènica i, desenvolupades en els darrers anys, aplicacions de diagnòstic. Els mètodes de detecció d'àcids nucleics són la tècnica de diagnòstic de referència a la clínica degut a la seua alta sensibilitat i especificitat. No obstant, de cara al futur, hem de desenvolupar mètodes versàtils de detecció de virus que permeten diagnòstics ràpids i fiables, que superen les limitacions de les tècniques actuals i puguen utilitzar-se fàcilment fora del laboratori per a aplicacions en punts d'atenció (POC). Els sistemes CRISPR-Cas han estat reorientats com a eines de diagnòstic d'àcids nucleics, fet possible per la capacitat d'algunes proteïnes Cas de realitzar un tall col·lateral no específic en reconèixer un objectiu. El nostre objectiu és ampliar el conjunt d'eines de diagnòstic CRISPR-Cas desenvolupant una nova estratègia de detecció d'àcids nucleics basada en CRISPR-Cas9, el mode d'acció del qual es basa en el desplaçament de cadena en lloc de la catàlisi col·lateral. Mostrem que es poden detectar amplicons de DNA de SARS-CoV-2 generats a partir de mostres de pacients amb CRISPR-Cas9. També demostrem la capacitat de realitzar la detecció simultània de diferents amplicons de DNA amb la mateixa nucleasa, ja siga per identificar diferents regions de SARS-CoV-2 o diferents virus respiratoris. Per avançar cap a aplicacions de punt d'atenció (POC), vam combinar el pas de preamplificació isotèrmica amb oligos biotinilats per produir amplicons etiquetats. Quan es combinen amb l'orientació CRISPR-Cas9 i sondes etiquetades amb FAM, això permet la visualització colorimètrica de la detecció mitjançant assajos de flux lateral (LFA) en tires comercials disponibles. La lectura colorimètrica permet la interpretació dels resultats a simple vista, superant la necessitat d'un fluorímetre. Vam detectar amb èxit el SARS-CoV-2 a partir de mostres de pacients en el sistema LFA, i quan es va combinar amb RT-RPA multiplexada, es va aconseguir la detecció de dues regions diferents del virus en una sola prova. A més, l'absència d'activitat col·lateral en la nostra metodologia permet el processament de seqüències addicionals. Per tant, també ens proposem explorar la capacitat d'integració de senyals del nostre mètode de detecció basat en CRISPR-Cas9. Demostrem que els circuits lògics d'ADN dissenyats poden processar diferents senyals de SARS-CoV-2 detectats pels complexos CRISPR. També vam intentar millorar el nostre sistema CRISPR-Cas9 per detectar tant proteïnes com àcids nucleics. Ens vam proposar dissenyar un ARN guia condicional que respon a la presència de la proteïna spike del SARS-CoV-2. Per aconseguir-ho, vam inserir una seqüència d'aptàmer dins de l'ARN guia per bloquejar l'activitat de Cas9 en absència de la proteïna. En presència de la proteïna spike, la interacció aptàmer-proteïna fa que el motiu de bloqueig experimente un canvi conformacional, alliberant l'ARN guia i activant Cas9. Tot i que vam aconseguir amb èxit el bloqueig utilitzant les seqüències reguladores, es necessita més treball per identificar una seqüència que puga induir el canvi conformacional específic necessari per restaurar l'activitat de Cas9 en presència de la proteïna spike. Col·lectivament, aquesta plataforma de diagnòstic CRISPR-Cas9 permet una detecció multiplexada en un sol tub, complementant els mètodes existents basats en CRISPR i oferint un sistema extensible per a aplicacions en diagnòstics de punt d'atenció i biocomputació. / [EN] CRISPR-Cas systems are based on an adaptive immune system mechanism found in bacteria and archaea. They function using RNA-guided endonucleases (Cas proteins), to target and recognize specific nucleic acid sequences. CRISPR-Cas systems are revolutionary in the field of genetic engineering, enabling specific genome editing, gene regulation assays and, developed in recent years, diagnostic applications. Nucleic acid detection methods are the gold-standard diagnostic technique in the clinic due to their high sensitivity and specificity. However, going forward, we must develop versatile virus detection methods that enable fast and reliable diagnostics and that can overcome the limitations of the current techniques and can be easily used outside the laboratory for point-of-care (POC) applications. CRISPR-Cas systems have been repurposed as nucleic acid diagnostic tools made possible by the ability of some Cas proteins to perform non-specific collateral cleavage upon target recognition. We aim to expand the CRISPR-Cas diagnostic toolkit by developing a novel nucleic acid detection strategy based on CRISPR-Cas9, whose mode of action relies on strand displacement rather than on collateral catalysis. We show that SARS-CoV-2 DNA amplicons generated from patient samples can be detected with CRISPR-Cas9. We also demonstrate the ability to perform simultaneous detection of different DNA amplicons with the same nuclease, either to identify different SARS-CoV-2 regions or different respiratory viruses. To advance toward POC applications, we coupled the isothermal preamplification step with biotinylated oligos to produce labelled amplicons. When combined with CRISPR-Cas9 targeting and FAM-labelled probes, this allows for colorimetric visualization of detection using lateral flow assays (LFA) on commercially available strips. The colorimetric readout enables interpretation of the results with the naked eye, surpassing the need for a fluorimeter. We successfully detected SARS-CoV-2 from patient samples in the LFA setup, and when combined with multiplexed RT-RPA, the detection of two distinct regions of the virus was achieved in a single test. Furthermore, the absence of collateral activity in our methodology allows for the processing of additional downstream sequences. Therefore, we also aim to explore the signal integration capability of our CRISPR-Cas9-based detection method. We demonstrate that engineered DNA logic circuits can process different SARS-CoV-2 signals detected by the CRISPR complexes. We also aimed to enhance our CRISPR-Cas9 system to sense both proteins and nucleic acids. We aimed to engineer a conditional guide RNA that responds to the presence of the SARS-CoV-2 spike protein. To achieve this, we inserted an aptamer sequence within the guide RNA to block Cas9 activity in the absence of the protein. Upon the presence of the spike protein, aptamer-protein interaction makes the blocking motif undergo a conformational change, releasing the guide RNA and activating Cas9. While we successfully achieved the blocking scenario using the regulatory sequences, further work is needed to identify a sequence that can induce the specific conformational change required to restore Cas9 activity upon spike protein presence. Collectively, this CRISPR-Cas9 diagnostic platform allows a multiplexed detection in a single tube, complementing the existing CRISPR-based methods, and offering an extensible system for applications in point-of-care diagnostics and biocomputing. / This work was supported by a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Science and Innovation (PRE2019-088531). / Márquez Costa, R. (2024). Engineering of CRISPR-Cas9-Based Systems for Diagnostics and Biocomputing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/210634