Düsseldorf, Univ., Diss., 2004. / Computerdatei im Fernzugriff.

Duisburg, Essen, Univ. Diss., 2004. / Computerdatei im Fernzugriff.

Duisburg, Essen, Universiẗat Diss., 2004.

Düsseldorf, Universiẗat, Diss., 2004.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2008.

G protein-coupled receptor research looks out for new technologies to elucidate the complex processes of receptor activation, function and downstream signaling with spatiotemporal resolution, preferably in living cells and organisms. A thriving approach consists in making use of the unsurpassed properties of light, including its high precision in space and time, noninvasiveness and high degree of orthogonality regarding biological processes. This is realized by the incorporation of molecular photoswitches, which are able to effectively respond to light, such as azobenzene, into the structure of a ligand of a given receptor. The muscarinic acetylcholine receptors belong to class A GPCRs and have received special attention in this regard due to their role as a prototypic pharmacological system and their therapeutic potential. They mediate the excitatory and inhibitory effects of the neurotransmitter acetylcholine and thus regulate diverse important biological processes, especially many neurological functions in our brain. In this work, the application of photopharmacological tool compounds to muscarinic receptors is presented, consisting of pharmacophores extended with azobenzene as light-responsive motif. Making use of the dualsteric concept, such photochromic ligands can be designed to bind concomitantly to the orthosteric and allosteric binding site of the receptor, which is demonstrated for BQCAAI (M1) and PAI (M2) and may lead to subtype- and functionalselective photoswitchable ligands, suitable for further ex vivo and in vivo studies. Moreover, photoswitchable ligands based on the synthetic agonist iperoxo were investigated extensively with regard to their photochemical behavior and pharmacological profile, outlining the advantages and challenges of using red-shifted molecular photoswitches, such as tetraortho- fluoro azobenzene. For the first time on a GPCR it was examined, which impact the different substitution pattern has on both the binding and the activity on the M1 receptor. Results show that substituted azobenzenes in photopharmacological compounds (F4-photoiperoxo and F4-iper-azo-iper) not just represent analogs with other photophysical properties but can exhibit a considerably different biological profile that has to be investigated carefully. The achievements gained in this study can give important new insights into the binding mode and time course of activation processes, enabling precise spatial and temporal resolution of the complex signaling pathway of muscarinic receptors. Due to their role as exemplary model system, these findings may be useful for the investigation into other therapeutically relevant GPCRs. / Die Forschung an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren verlangt nach neuen Technologien zur Aufklärung der komplexen Prozesse der Rezeptoraktivierung, -funktion und ihrer nachgeschalteten Signalwege mit räumlicher und zeitlicher Auflösung, vorzugsweise in lebenden Zellen und Organismen. Ein erfolgreicher Ansatz besteht darin, die unübertroffenen Eigenschaften des Lichts zu nutzen, welche die hohe Präzision in Raum und Zeit, die Nicht- Invasivität und die hohe Orthogonalität in Bezug auf biologische Prozesse einschließt. Dies wird durch den Einbau von molekularen Photoschaltern, wie z. B. Azobenzolen, in die Struktur eines Liganden eines bestimmten Rezeptors realisiert, welche effektiv auf Licht reagieren. Die muskarinischen Acetylcholin Rezeptoren gehören zur Klasse A der GPCRs und haben aufgrund ihrer Rolle als prototypisches pharmakologisches System und ihres therapeutischen Potenzials diesbezüglich besondere Beachtung gefunden. Sie vermitteln die stimulierenden und hemmenden Wirkungen des Neurotransmitters Acetylcholin und regulieren somit verschiedene wichtige biologische Prozesse, insbesondere viele neurologische Funktionen in unserem Gehirn. In dieser Arbeit wird die Anwendung photopharmakologischer „Tool“-Verbindungen auf die muskarinischen Rezeptoren vorgestellt, die aus Pharmakophoren bestehen, welche mit Azobenzol als lichtempfindlichem Motiv modifiziert wurden. Mit Hilfe des Konzepts der Dualsterie können solche photochromen Liganden so gestaltet werden, dass sie gleichzeitig an die orthosterische und allosterische Bindungsstelle des Rezeptors binden, was für BQCAAI (M1) und PAI (M2) gezeigt wurde und zu subtypen- und funktionsselektiven photoschaltbaren Liganden führen kann, die für weitere Ex- und In-Vivo-Studien geeignet sind. Darüber hinaus wurden photoschaltbare Liganden auf Basis des synthetischen Agonisten Iperoxo hinsichtlich ihres photochemischen Verhaltens und ihres pharmakologischen Profils ausführlich untersucht, um die Vorteile und Herausforderungen der Verwendung rotverschobener molekularer Photoschalter wie tetra-ortho-Fluor-azobenzol zu erläutern. Es wurde erstmals an einem GPCR untersucht, welche Auswirkungen das unterschiedliche Substitutionsmuster sowohl auf die Bindung, als auch auf die Aktivität am M1-Rezeptor hat. Diese Ergebnisse zeigen, dass substituierte Azobenzole in photopharmakologischen Verbindungen (F4-Photoiperoxo und F4-Iper-azo-iper) nicht nur Analoga mit anderen photophysikalischen Eigenschaften darstellen, sondern auch ein deutlich unterschiedliches biologisches Profil aufweisen können, das sorgfältig untersucht werden muss. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse geben neue und wichtige Einblicke in den Bindungsmodus und den zeitlichen Verlauf von Aktivierungsprozessen und ermöglichen eine präzise räumliche und zeitliche Auflösung der komplexen Signalwege von muskarinischen Rezeptoren. Aufgrund ihrer Rolle als exemplarisches Modellsystem können diese Befunde für die Untersuchung anderer therapeutisch relevanter GPCRs sehr nützlich sein.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese von Liganden muscarinerger Rezeptoren, die zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören. Die fünf Muscarinrezeptor-Subtypen weisen im Bereich der orthosteren Bindungsstelle, an die u. a. der endogene Ligand Acetylcholin bindet, einen hohen Konservierungsgrad der Aminosäuresequenz auf. Alle Muscarinrezeptoren weisen neben der orthosteren Bindungsstelle auch eine oder mehrere allostere Bindungsstellen auf. Da diese sich im weniger konservierten extrazellulären Bereich des Rezeptors befinden, ist es möglich subtypspezifische Liganden zu entwickeln. Allostere Modulatoren binden an diese topographisch andere Stelle des Rezeptors und sind in der Lage, gezielt die Bindung eines orthosteren Agonisten oder Antagonisten zu modulieren. Dies bedeutet, dass sie die Assoziation und die Dissoziation orthosterer Agonisten und Antagonisten beeinflussen können. Die Gleichgewichtsbindung des Orthosters kann erhöht (d. h. positive Kooperativität), erniedrigt (d. h. negative Kooperativität) bzw. nicht beeinflusst (d. h. neutrale Kooperativität) werden. Das Ziel der Arbeit bestand zunächst darin, die Synthese allosterer Modulatoren des M2-Rezeptors vom Bis(ammonium)alkan-Typ, wie W84 und Naphmethonium, zu optimieren. Da die Synthesen dieser bisquartären Verbindungen zeitaufwändig sind, wurden die Synthesen durch Einsatz einer Synthesemikrowelle optimiert, um neue Bis(ammonium)alkan-Verbindungen effizienter synthetisieren zu können. Der Vergleich beider Synthesemethoden (konventionell bzw. Mikrowellen-unterstützt) zeigt sehr deutlich, dass die Reaktionszeiten durch Einsatz einer Synthesemikrowelle drastisch verkürzt werden konnten, insbesondere bei Verbindungen, die sehr lange Reaktionszeiten beanspruchen. Zusätzlich konnten die Ausbeuten aller synthetisierten Verbindungen durch Mikrowellen-unterstützte Synthese z. T. deutlich gesteigert werden. Im Verlauf der Arbeit wurden unsymmetrisch und symmetrisch nitrosubstituierte Bisnaphthalimide hergestellt. Durch Mikrowellen-unterstützte Hydrierung unter Palladium/Kohle-Katalyse wurden anschließend die analogen aminosubstituierten Derivate erhalten. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, ein Naphmethonium-Derivat herzustellen, das über einen Spacer mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden kann. Ein Farbstoff-markierter allosterer Modulator könnte als ein wichtiges pharmakologisches Werkzeug zur direkten Charakterisierung allosterer Interaktionen und zur Verfolgung des „Rezeptor-Traffickings“ mittels Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie genutzt werden. Als Spacer diente eine Alkylkette mit endständiger primärer Aminofunktion, die mit Alexa-Fluor 532 gekoppelt werden sollte. Zur Einführung des Spacers wurden verschiedene Strategien verfolgt. Schließlich konnte Verbindung 3h über eine Chlorzwischenstufe hergestellt werden, über deren freie primäre Aminogruppe der Fluoreszenzfarbstoff in weiteren Arbeiten gekoppelt werden kann. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Syntheseoptimierung des hochpotenten unselektiven Agonisten Iperoxo, das eine für akademische Zwecke wichtige Substanz in der pharmakologischen Testung und ein wichtiges Zwischenprodukt in der Synthese bivalenter Agonist/Alloster-Hybridverbindungen ist. Die Ausbeuten aller Stufen konnten erhöht und die Gesamtausbeute signifikant von 13% auf 22% gesteigert werden. Außerdem wurden neue Agonisten hergestellt, die sich im Heterozyklus unterscheiden. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Synthese bivalenter Hybridverbindungen nach dem Nachrichten-Adressen-Modell von Schwyzer. Zum einen sollten Agonist/Alloster-Hybridverbindungen synthetisiert werden, wobei die in der Literatur beschriebene Hybridverbindung Hybrid 1 (W84 und Iperoxo) als Leitstruktur diente. So wurde im ersten Schritt eine auf der allosteren Seite verkürzte Substanz ohne Phthalimidopropyl-Rest hergestellt (Hexamethonium und Iperoxo). Danach wurden verschiedene Funktionalitäten an der lateralen quartären Ammoniumfunktion eingeführt. Daneben wurden erstmals Antagonist/Alloster-Hybridverbindungen hergestellt, die aus einem M2-selektiven allosteren Modulator (W84, Naphmethonium bzw. Hexamethonium) und einem subtypunspezifischen Antagonisten (Atropin bzw. Scopolamin) bestehen. Im ersten Schritt wurde der allostere Molekülteil nach der optimierten Mikrowellen-unterstützten Synthese hergestellt. Die erhaltenen Zwischenstufen 2 wurden im Anschluss mit Atropin und Scopolamin in Acetonitril umgesetzt und die Antagonist/Alloster-Hybridverbindungen 34 und 35 erhalten. Die pharmakologische Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte durch Radioligandbindungsstudien an Herzventrikelgewebe des Hausschweins. Der allostere Effekt der Testsubstanzen wurde indirekt über die Verzögerung der Dissoziation des radioaktiv markierten orthosteren Antagonisten [3H]N-Methylscopolamin. / The present work focussed on the synthesis and characterisation of ligands of muscarinic receptors belonging to the superfamily of G-protein-coupled receptors. The five known subtypes of muscarinic receptors (M1-M5) are located ubiquitary in the mammalian organism and participate in many physiological procedures. The endogenous ligand acetylcholine and classical antagonists bind to the orthosteric binding site, which is located deeply in the receptor channel and exhibit a highly conserved amino acid sequence. Allosteric modulators bind to a topographically different site than classical orthosteric ligands. The allosteric binding sites are located in the external loops of the receptor protein. Since these regions exhibit a less conserved structure it is possible to design allosteric modulators capable of binding selectively to specific subtypes and modulating the efficiency of the orthosteric ligand. An allosteric modulator has the ability to affect equilibrium binding of the orthosteric agonist or antagonist: equilibrium binding can either be increased (= positive cooperativity), decreased (= negative cooperativity) or left unaltered (= neutral cooperativity). One intention of this work was to optimize the synthetic pathway to bis(ammonio)alkane-type allosteric modulators of the M2-receptor, like W84 or naphmethonio. The syntheses to these bisquaternary compounds are time consuming. In order to obtain new potent bis(ammonio)alkane-compounds the syntheses were optimized by using a microwave oven. Comparing the conversion times of conventional and microwave-assisted heating revealed a substantially speed up in the synthetic pathway particularly for the reactions which took the longest under conventional reflux conditions. Additionally, the yields of all synthesized compounds could be increased by means of microwave-assisted synthesis. In this work symmetrical and non-symmetrical nitro-substituted bisnaphthalimides were synthesized and the analogue amino-substituted compounds were obtained by microwave-assisted hydrogenation afterwards. A further aim of this work was to synthesize a naphmethonio-derivative which is suitable for a connection to a fluorescent dye. A fluorescent naphmethonio-derivative may help to characterize allosteric interactions directly and trace receptor trafficking by means of fluorescence correlation spectroscopy. Firstly, a primary amino group should be connected via an alkyl-spacer to the allosteric modulator and secondly, this intermediate should be combined with the fluorescent dye alexa-fluor-532. Several strategies were prosecuted. Finally, the synthesis of compound 3h via a chloride-intermediate was successful. Another intention of this work was to optimize the synthetic pathway to the non-selective muscarinic agonist iperoxo, which is an important reference compound in the pharmacological testing and an intermediate in the synthetic pathway of bivalent agonist/allosteric modulator hybrid compounds. The yields in each reaction step were enhanced and the total yield was increased from 13 % to 22 %. Furthermore, other muscarinic agonists differing in the substitution pattern of the heterocycle were synthesized. A further aim of this work was to synthesize bivalent hybrid compounds combining an orthosteric and an allosteric ligand in one molecule. Following Schwyzer´s concept of hybrid compounds containing an “address” skeleton that binds selectively to a receptor subtype and a non-selective “message” moiety inducing agonism or antagonism, a group of hybrid hexamethonio-type derivatives has been designed as subtype selective agonists and antagonists. Hybrid 1 served as a lead for the agonist/allosteric modulator-hybrid compounds synthesized in this work. Firstly, the goal was to combine the agonist iperoxo with hexamethonio and secondly, to introduce a different substitution pattern at the lateral quaternary ammonio-group in the obtained iperoxo/hexamethonio-hybrid compound 27a. Another aim of this work was to synthesize antagonist/allosteric modulator hybrid compounds. Therefore, the classical antagonists atropine and scopolamine were connected with the allosteric agents W84, naphmethonio and hexamethonio via hexyl-spacer. The pharmacological testing of all compounds was accomplished by radioligand binding studies in homogenates of porcine heart ventricles. The resulting allosteric effect was determined by measuring the inhibition of the dissociation of the radioactive marked orthosteric antagonist [3H]N-methylscopolamine ([3H]NMS). In equilibrium binding studies information about the affinity of the allosteric modulators to the free receptor and about the cooperativity between the allosteric and the orthosteric ligand was obtained.

Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (Kir), aktuell in die 7 Unterfamilien Kir1-Kir7 eingeteilt, sind an der Regulation einer Vielzahl von Körperfunktionen, beispielsweise Herzfrequenz, Erregbarkeit von Nervenzellen, Tonus von Gefäßmuskelzellen, Hormonsekretion oder Aktivierung von Immunzellen, beteiligt. Für die Kontrolle dieser Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Leitfähigkeit dieser Kanäle beeinflusst werden kann. Die Kir3-Unterfamilie (früher GIRK für G-protein-activated-K+-channels) wird beispielsweise obligat durch die direkte Bindung der beta/gamma-Untereinheit des trimeren Gi/0-Proteins aktiviert (Karschin, 1999). Es gibt Hinweise in der Literatur, dass auch die stark einwärts gleichrichtenden Kanäle der Kir2-Familie durch G-Proteine der Gq-Familie reguliert sein können. Dabei widersprechen sich insbesondere zwei Untersuchungen zur Spezifität der Interaktion (Jones, 1996; Chuang et al., 1997). Ebenso ist der intrazelluläre Signalweg bislang nicht hinreichend geklärt. Um dies genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit die Kir-Kanäle Kir2.1-Kir2.4 jeweils mit 5 verschiedenen Gq-gekoppelten Rezeptoren in Xenopus-Oozyten koexprimiert und mit der Technik der „Zwei-Elektroden-Spannungsklemme“ der Strom über die Kir-Kanäle vor und nach Rezeptoraktivierung mit dem jeweils physiologischen Rezeptoragonisten gemessen. Es zeigte sich, dass ausschließlich Kir2.3 nach Aktivierung des M1-Acetylcholinrezeptors inhibiert wird. Eine Sequenzanalyse zeigte in der Extrazellulärregion von Kir2.3 eine zu den anderen Kir2-Kanälen abweichende Aminosäuresequenz, welche durch Mutation aber als potentielle Bindestelle zur Vermittlung des inhibitorischen Effektes ausgeschlossen werden konnte. Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die Koexpression von Kir2.3 und M1-Acetylcholinrezeptor in bestimmten Gehirnregionen der Kontrolle neuronaler Erregbarkeit dient (Shen et al., 2007), ist es wahrscheinlich, dass derselbe Mechanismus auch in ventrikulären Kardiomyozyten existiert und dort als Schutzmechanismus vor vagaler Überstimulation fungiert. / Inwardly rectifying K+ (Kir) channels, which can be classified into the subfamilies Kir1-Kir7, participate in the regulation of many functions of the human organism, e.g. heart rate, excitability of neurons or hormone release. In order to control these functions it is important that the conductance of these channels can be modulated. Channels of the Kir2 subfamily are regulated by Gi/o-coupled as well as Gq/11-coupled receptors. So far, it is still under debate whether these receptors selectively target to different members of the Kir2 subfamily. In order to investigate this issue rat Kir2.1-2.4 and Gq-coupled seven-helix receptors were coexpressed in Xenopus laevis oocytes and two electrode voltage-clamp measurements were performed recording the inwardly rectifying potassium currents before and after receptor activation. We showed that Kir2.3 is selectively inhibited by activation of the acetylcholine M1 receptor, whereas Kir2.1, 2.2 and 2.4 are not affected by activation of the M1 receptor. All other Gq-coupled receptors tested have no influence on Kir2 currents. Furthermore, mutation of a putative binding site within the extracellular loop between transmembrane region M1 and the pore region of rat Kir2.3 has no influence on M1 receptor induced inhibition. As it has been demonstrated that the cholinergic modulation of Kir2.3 channels selectively elevates dendritic excitability in certain brain areas (Shen et al., 2007), we postulate that the same mechanism also exists in cardiomyocytes in order to protect the heart function against an overwhelming parasympathetic stimulation.

Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2008

University, Diss.--Frankfurt/M., 2000.