Thesis--Virginia Polytechnic Institute and State University. / Also available via the Internet.

This master’s thesis is focused on evaluation of synthetic musk fragrances using ecotoxicity tests. Four musk fragrances were tested – Galaxolide, Tonalide, Musk ketone and Musk xylene. Four alternative ecotoxicity tests with living organisms, one standard ecotoxicity test and three fytotests were used for evaluation of ecotoxicity. Alternative tests were performed on crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus, brine shrimp Artemia salina and rotifer Brachionus calicyflorus. Root growth inhibition test of Sinapis alba, root growth inhibition test of Lactuca sativa, root growth inhibition test of Allium cepa and growth inhibition test of Lemna minor were performed in the terms of fytotests. On the basis of the results the values of EC50, IC50 and LC50 were determined and the ecotoxicity of musk compounds was evaluated.

No description available.

Σκοποί της εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη της MuSK-MG (μυασθένεια με αντι-MuSK αντισώματα) στην Ελλάδα, ο προσδιορισμός των υποτάξεων των IgG αυτοαντισωμάτων της MuSK-MG, η επίδραση της χορήγησης 4 MuSK-MG ορών στον AChR (υποδοχέα ακετυλοχολίνης) των κυττάρων της μυϊκής κυτταρικής σειράς ΤΕ671 και ο προσδιορισμός των ανοσογόνων επιτόπων της MuSK. Η επιδημιολογική μελέτη της MuSK-MG έλαβε χώρα μεταξύ 1 Ιανουαρίου 1986 και 30 Ιουνίου 2006 κι αφορούσε σε 33 ασθενείς. Ο προσδιορισμός των υποτάξεων των IgG αυτοαντισωμάτων πραγματοποιήθηκε με ραδιοανοσοκατακρήμνιση στους ορούς 14 ασθενών. Ο προσδιορισμός των ανοσογόνων επιτόπων της MuSK πραγματοποιήθηκε συνθέτοντας το εξωκυτταρικό κομμάτι της MuSK με τη μέθοδο Geysen της σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση κι ελέγχοντας, στη συνέχεια, με τη μέθοδο ELISA, τη δέσμευση μιας σειράς MuSK-MG ορών στο τμήμα της MuSK που συνθέσαμε. Η μέση ετήσια επίπτωση της MuSK-MG στην Ελλάδα ήταν 0,32 ασθενείς/εκατομμύριο πληθυσμού/έτος. Στις γυναίκες, η έναρξη της MuSK-MG εμφανίστηκε μετά τα 30, ενώ, στους άνδρες, η νόσος εμφανίζεται σε κάθε δεκαετία. Οι περισσότεροι ασθενείς εμφάνισαν συμπτώματα από τους προσωπικούς κι αυχενικούς μύες. Η συντριπτική πλειονότητα των αυτοαντισωμάτων της MuSK-MG ήταν IgG4 υποτάξης. Σχετικά με την επίδραση των 4 MuSK-MG ορών στον AChR, οι οροί αυτοί ήταν ανίκανοι στην πρόκληση αποδόμησης του AChR των κυττάρων. Τέλος, δεν κατέστη δυνατός ο προσδιορισμός των ανοσογόνων επιτόπων της MuSK, αφού υπήρχαν αμινοξικές αλληλουχίες, στις οποίες ο αρνητικός μάρτυρας του πειράματος δεσμευόταν ισχυρότερα σε σχέση με τους MuSK-MG ορούς που δοκιμάσαμε. / The purposes of this study were to determine the epidemiological characteristics of muscle-specific kinase-myasthenia gravis (MuSK-MG) in Greece, the IgG subclass of the anti-MuSK antibodies, the effect of 4 MuSK-MG sera on the AChR of the cells of muscle cell line TE671 and the immunodominant epitopes of MuSK. This population-based study was performed on MuSK-MG patients in Greece between 1 January 1986 and 30 June 2006. Epidemiological and clinical data for 33 patients were collected. In addition, the distribution of anti-MuSK IgG autoantibody subclasses in the sera of 14 patients was determined by immunoprecipitation. The determination of the immunodominant epitopes on MuSK was performed by synthesizing the extracellular part of MuSK via Geysen method of peptide synthesis. Then, we performed ELISA method in order to determine the epitopes. The average annual incidence was 0.32 patients/million population/year. In females, onset of MuSK-MG occurred after the age of 30, whilst, in males, the disease appears in any decade. Most patients presented with involvement of the facial and bulbar muscles. The vast majority of anti-MuSK antibodies were IgG4. As far as the the effect of 4 MuSK-MG sera on the AChR of the cells is concerned, these sera were incapable of destroying the AChR effectively. Finally, we did not determine the immunodominant epitopes on MuSK, as there were amino acid sequences on which the negative control was bound with greater affinity than the MuSK-MG sera we tested.

Thesis (Ph. D.)--University of Canterbury, 2007. / Typescript (photocopy). Includes bibliographical references (p. 137-154). Also available via the World Wide Web.

Thesis--Virginia Polytechnic Institute and State University. / Vita. Abstract. Includes bibliographical references (leaves 51-70). Also available via the Internet.

Products of daily use, which are mainly cosmetics and personal care products could significantly affect the environment. Recently, in terms of environmental protection, organic compounds responsible for the pleasant smell of these products - synthetic fragrances or musk compounds - are often mentioned. This diploma thesis aims to assess the ecotoxicity of several new substances from the group linear (alicyclic) musk compounds. From this group following fragrance ingrediens were tested: lilial, linalool, arocete and aroflorone. Since the majority of their residues enter the aquatic ecosystem, aquatic freshwater crustacean Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus and aquatic plant Lemna minor were selected as test organisms. Individual ecotoxicity of above mentioned substances was evaluated as well as toxicity of binary mixture of arofloron and linalool on organisms Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Based on the test results the ecotoxicological values LC50, EC50 and IC50 for the tested substances were evaluated and their ecotoxicity was compared. Lilial showed the highest ecotoxicity. Value of 24h EC50 for organism Daphnia magna was 2.13 mg/l and value of 24h LC50 for the organism Thamnocephalus platyurus was 10.86 mg/l.

Η μυασθένεια gravis (Myasthenia gravis, MG) είναι μία αυτοάνοση νόσος η οποία επηρεάζει την ομαλή λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (80-85%) εμφανίζουν αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (AChR), ενώ 5-7% των ασθενών εμφανίζουν αντισώματα έναντι της ειδικής κινάσης μυϊκής (MuSK). Η MuSK είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη της νευρομυϊκής σύναψης αλλά επίσης, εκφράζεται και στην ώριμη νευρομυϊκή σύναψη όπου εμπλέκεται, μέσω της αγρίνης, στην αγκυροβόληση των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στη μεμβράνη. Η MuSK αποτελείται από μια εξωκυτταρική περιοχή (ECD), η οποία περιέχει τρεις περιοχές τύπου–ανοσοσφαιρίνης (Ig-like) και μια περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (Fz), μια διαμεμβρανική και μία κυτταροπλασματική περιοχή η οποία περιέχει την καταλυτική περιοχή της κινάσης. Οι θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Ωστόσο, η ανοσοκαταστολή συχνά συνδέεται με σοβαρές παρενέργειες ενώ κατά τη χορήγηση ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών, η πιθανότητα μετάγγισης άγνωστων μέχρι στιγμής μολυσματικών παραγόντων δεν μπορεί να αποκλειστεί. Επιπλέον, σε καμία από τις παραπάνω θεραπευτικές προσεγγίσεις δεν στοχεύονται επιλεκτικά τα αντισώματα και ταυτόχρονα συνοδεύονται από υψηλό κόστος εφαρμογής και περιορισμένη διαθεσιμότητα. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την MuSK μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της ανοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK ως ανοσοπροσροφητή σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες οι οποίες θα αφαιρούν από τον ορό του ασθενούς μόνο τα MuSK αντισώματα. Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK σε διάφορα συστήματα έκφρασης στοχεύοντας στη δημιουργία ενός ανοσοπροσροφητή ο οποίος παράγεται σε μεγάλες ποσότητες αλλά και σε μία διαμόρφωση η οποία είναι ικανή να αναγνωρίζεται από την πλειονότητα των MuSK αντισωμάτων. Με σκοπό τη δημιουργία κατάλληλων ανοσοπροσροφητών εκφράστηκαν δύο διαφορετικές πρωτεΐνες, όπου η μία αποτελείται από ολόκληρο το εξωκυτταρικό τμήμα της MuSK (MuSK-ECDf) ενώ η άλλη είναι μικρότερη αφού υπολείπεται την περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (MuSK-ECDΔFz). Οι προσπάθειες στα συστήματα έκφρασης COS-7, HEK293 και E.coli απέβησαν άκαρπες αφού είτε οι πρωτεΐνες δεν εκφράστηκαν στη σωστή διαμόρφωση ή δεν αποδείχθηκαν κατάλληλοι ανοσοπροσροφητές. Και οι δύο πρωτεΐνες εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή και σε ικανοποιητικά επίπεδα έκφρασης με την MuSK-ECDf πρωτεΐνη να εμφανίζει καλύτερα επίπεδα έκφρασης. Μετά τον καθαρισμό των δύο πρωτεϊνών με χρωματογραφίες συγγένειας και μοριακής διήθησης, οι πρωτεΐνες ακινητοποιήθηκαν σε υπόστρωμα σεφαρόζης και ακολούθησε ο χαρακτηρισμός τους ως ανοσοπροσροφητές. Και οι δύο ανοσοπροσροφητές έχουν τη δυνατότητα να αφαιρούν την πλειονότητα των MuSK αντισωμάτων από τον ορό των MuSK-μυασθενών με τον MuSK-ECDΔFz ανοσοπροσροφητή να εμφανίζει μικρότερη ικανότητα πρόσδεσης αντισωμάτων σε ορισμένους ορούς. Ο χαρακτηρισμός των δύο ανοσοπροσροφητών έδειξε ότι και οι δύο είναι ειδικοί για τα MuSK αντισώματα, μπορούν να αφαιρούν μεγάλες ποσότητες MuSK αντισωμάτων από τον ορό MuSK-μυασθενών, μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν, να αποθηκευτούν για μεγάλο χρονικό διάστημα και επίσης, παραμένουν σταθεροί στο υπόστρωμα σεφαρόζης κατά τη διάρκεια της ανοσοπροσρόφησης. Όι παραπάνω παράμετροι μπορούν να οδηγήσουν σε μία θεραπευτική προσέγγιση με χαμηλό κόστος για τον ασθενή αλλά ιδιαίτερα αποτελεσματική ως προς την αφαίρεση μόνο των παθογόνων MuSK αντισωμάτων. Στη συνέχεια, ακολούθησαν πειράματα χρησιμοποιώντας ζώα εργαστηρίου στα οποία φάνηκε ότι τα πειράματα ανοσοπροσρόφησης με τον MuSK-ECDf ανοσοπροσροφητή δεν εμφανίζουν καμία τοξική επίδραση σε κουνέλια. Επίσης, με πειράματα παθητικής μεταφοράς σε ποντίκια αποδείχθηκε η αποτελεσματικότητα των ανοσοπροσροφητικών στηλών να αφαιρούν τα MuSK αντισώματα από τον ορό των MuSK-μυασθενών όπως επίσης και η παθογονικότητα των απομονωμένων MuSK αντισωμάτων. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα καθιστούν εφικτή την ανάπτυξη μίας νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη MuSK μυασθένεια με χαμηλό κόστος για τον ασθενή και με το πλεονέκτημα της επιλεκτικής αφαίρεσης των MuSK αντισωμάτων από τον ορό. / Myasthenia gravis (MG) is an antibody-mediated autoimmune disease that affects the neuromuscular junction (NMJ). About 85% of MG patients have antibodies against the muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR), while about 5-7% of patients have antibodies against the muscle specific kinase (MuSK). MuSK is important during the development of the NMJ and it is also expressed at the mature NMJ, where it mediates the agrin-induced clustering of AChRs. MuSK is a transmembrane protein which consists of an extracellular region, a transmembrane domain and an intracellular, tyrosine kinase, catalytic domain. The extracellular domain (ECD) consists of three immunoglobulin–like (Ig) domains and a cysteine-rich domain (CRD). Current treatments of MG, such as cholinesterase inhibitors, immunosuppressive agents, intravenous immunoglobulin, thymectomy and plasmapheresis, are non specific, causing several side effects such as the removal of indispensable plasma components observed by plasmapheresis. We aim to develop an antigen-specific therapy in which only MuSK antibodies will be removed from patients’ sera using the immobilized MuSK-ECD as immunoadsorbent. Furthermore, the above treatments are not specific for the removal of the pathogenic antibodies and also, they have high cost and limited availability for the patients. The selective removal of MuSK antibodies from the blood of MuSK-MG patients with an extracorporeal technique similar to plasmapheresis could be a therapeutic option. The method is based on the immobilization of the extracellular domain (ECD) of MuSK as immunoabsorbent in an appropriate substrate for the construction of immunoadsorption columns which remove the MuSK antibodies from the MuSK-MG sera. The purpose of the current project was the expression of the ECD of MuSK in different expression systems in high amounts with appropriate conformation for the recognition of the majority of the MuSK antibodies and their use as immunoabsorbents. For the development of the appropriate immunoabsorbents, two different proteins were expressed; the one consisted of the whole ECD of MuSK (MuSK-ECDf) and the other was smaller because of the lack of the cysteine-rich region (MuSK-ECDΔFz). All efforts for protein expression in COS-7, HEK293 and E. coli were not successful because either the expression proteins were not in appropriate conformation or they worked not efficiently as immunoabsorbents. However, both proteins were expressed successfully in the heterologous system P. pastoris as secreted soluble proteins with satisfactory expression yields and much higher expression yield of MuSK-ECDΔFz than that of MuSK-ECDf. After the protein purification using metal affinity and gel filtration chromatography, the proteins were immobilized on CNBr activated sepharose beads and characterized as immunoabsorbents. Both immunoabsorbents remove effectively the majority of the MuSK antibodies from MG patients’ sera with the MuSK-ECDΔFz immunoadsorbent to show lower binding affinity in some sera. Further, both immunoaborbents are specific for the MuSK antibodies, show high binding capacity, are recyclable, can be stored effectively and are stable during the immunoadsorption. Furthermore, animal experiments showed that the ex-vivo clearance of plasma with the immobilized MuSK-ECDf had no toxic effects in rabbits. Finally, passive transfer experiments in mice showed the effectiveness of the immunoadsorption columns regarding the removal of the MuSK antibodies from patients’ sera and also, the pathogenicity of the removed MuSK antibodies. In conclusion, the above results are expected to lead to a therapeutic approach using the MuSK-ECD as specific immunoadsorbent for the ex vivo clearance of the MuSK-MG plasma and in parallel with a small cost for the patient.

Η πρωτείνη MuSK (Muscle Specific Kinase) αποτελεί μέρος ενός συμπλόκου υποδοχέων της αγκρίνης (agrin) οι οποίοι διεγείρουν την φωσφορυλίωση της τυροσίνης και οδηγούν στην ομαδοποίηση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης (AChRs) στην μετασυναπτική μεμβράνη της νευρομυϊκής σύναψης των σπονδυλωτών οργανισμών. Μεταλλάξεις της MuSK είναι υπεύθυνες για ασθένειες και δυσλειτουργίες της νευρομυϊκής σύναψης, όπως το εκ γενετής μυασθενικό σύνδρομο. Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον για την πρωτεΐνη MuSK έχει αυξηθεί, αλλά παρόλα αυτά δεν έχουν αποδειχθεί πλήρως, ούτε ο ρόλος της, ούτε η λειτουργία της ,ούτε η δομής της. Χρησιμοποιώντας τεχνικές μοντελοποίησης μέσω ομολογίας και χρησιμοποιώντας ως εκμαγεία γνωστές κρυσταλλογραφικές δομές, δημιουργήθηκε το υπολογιστικό μοντέλο της ανθρώπινης MuSK. Για την μελέτη της συμπεριφοράς της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής σε υδατικό περιβάλλον όπου εξήχθησαν συμπεράσματα για τον προσανατολισμό της δομής, τις αλληλεπιδράσεις των τμημάτων της και την συνολική συμπεριφορά του μορίου. / The protein MuSK (Muscle specific Kinase) is part of an agrin receptor complex which stimulates tyrosine phosphorylation and lead to the clustering of acetylcholine receptors (AChRs) in the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction of vertebrate organisms. MuSK mutations are responsible for diseases and disorders of the neuromuscular junction, such as congenital myasthenic syndrome. In recent years interest over MuSK protein has increased, but till now neither the role nor function, nor the structure of the protein have been fully demonstrated. Using homology modeling techniques and based on templates of known crystallographic structures, we have generated in silico the model of human MuSK. To study the behavior of the protein we used molecular dynamics simulations carried out in an aqueous environment where conclusions were reached on the orientation of the structure, interactions between the domains of the protein and the overall behavior of the molecule.

Synthetic musk compounds were first prepared artificially in the late 19th century. They have been used to perfume cosmetics, detergents and personal care products. The attention of many researchers has been focused on it recently, due to its high penetration into the nature which is a logical consequence of its great use. The main goal of this thesis is to determine the effect of the ultrafiltration on the concentration reduction of substances mentioned above in the industrial waste waters produced by the cosmetic company. Analytes from the sample were extracted using solid phase microextraction (SPME) and on gas chromatography analysis with mass spectroscopy (GC / MS) has been performed. The whole method was optimized and evaluated. Determination of the average efficiency of the ultrafiltration was made based on data obtained before and after ultrafiltration. Such efficiency determines the suitability of use of this method for removal of synthetic musk compounds from waste waters.