Resumo: Mutantes foram obtidos através de tratamento mutagênico dos esporos de S. clavuligerus ATCC 27064 com metil-metanosulfonato. Um total de 822 colônias, obtidas por repiques sucessivos, foram selecionadas em testes qualitativos e/ou quantitativos. O melhor mutante S. clavuligerus 45.41, mostrou-se de duas a quatro vezes mais produtivo que a linhagem selvagem, e manteve-se estável após 35 repiques sucessivos ao longo deste estudo. O comportamento das linhagens foi investigado pela adição de diferentes diaminas ao meio de cultivo, uma a uma, na ausência de lisina. Também se investigou duas fontes distintas de C, além de compostos como o ácido 2,6- diaminopimélico. Um planejamento de dois fatores (cadaverina e lisina), três níveis, baseado no ponto central, faces centradas, indicou que a adição de lisina aumenta a produção de CefC para ambas as linhagens. O efeito positivo da cadaverina foi observado principalmente na linhagem mutante 45.41. Resultados obtidos em processo de batelada, em biorreator de bancada confirmaram as diferenças observadas entre as linhagens nos cultivos em frascos agitados. Procedimento de mutagênese clássica foi utilizado em conjunto com critérios bem definidos para se estabelecer um meio de cultura apropriado, com o objetivo de alcançar um aumento significativo da produção de CefC. Este é o primeiro estudo utilizando um mutante de S. clavuligerus obtido por mutagênese clássica, cuja produção de CefC é de três vezes maior que a da linhagem selvagem, em meios contendo diaminas / Abstract: Mutants were obtained by treating S. clavuligerus ATCC 27064 spores with methyl-methanesulfonate. A total of 822 colonies, obtained by successive sampling, were selected by qualitative and/or quantitative tests. The best mutant, S. clavuligerus 45.41, was two to four times more productive than the wild-type strain, and remained stable even after 35 successive samplings throughout the study. Strains behavior was investigated by adding different diamines in media, one by one, in the absence of lysine. Also investigated two different sources of C, and compounds such as 2,6-diaminopimelic acid. The two-factor (cadaverine and lysine), three-level, central composite-based, face-centered experimental design indicates that adding lysine increases CephC production for both strains alike. The positive effect of cadaverine was observed mainly in the Mutant 45.41 strain. Results obtained in batch-processes in a bench-scale bioreactor confirmed differences among strains observed in shaken flasks cultures. Classical mutagenesis procedures in conjunction with the adoption of well-defined criteria to establish an appropriate culture medium promoted a significant improvement in CephC production. It is the first study indicating an increase in CephC production in media containing diamines employing a mutant of S. clavuligerus obtained by classical mutagenesis / Orientador: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: Pedro de Oliva Neto / Banca: Cecilia Laluce / Banca: José Gregório Cabrera Gomez / Banca: Cristina Paiva de Sousa / Doutor

Resumo: Rhizobium tropici e outras bactérias pertencentes à ordem Rhizobiales são produtores de polissacarídeos extracelulares (EPS), que possuem a função de molécula receptora do micro simbionte, fazendo uma interação célula/célula e desencadeando o processo de nodulação. A diversidade de estruturas e composição química apresentadas pelas moléculas de EPS é refletida pela diversidade de enzimas responsáveis pela sua síntese. Neste trabalho, buscou-se a inativação através da mutagênese insercional por transposição in vitro dos genes exoZ da estirpe selvagem Rhizobium tropici SEMIA 4080 envolvidas na síntese das subunidades repetitivas do EPS e no tanden phbAB, responsáveis pela síntese do PHB, com o intuito de obter microrganismos com aspecto altamente mucoso, produtor superior de EPS em relação a estirpe selvagem. Os mutantes obtidos apresentaram colônias mucosas quando cultivados nos meios de culturas PSYA, demonstrando que estirpes de rizóbio mutantes nos genes exoZ e phbAB são capazes de formar biofilme "in vitro" e, ao avaliar a eficiência relativa na produção de EPS, o mutante 4080 Z03 apresentou o melhor resultado. Para as três amostras de EPS foi possível observar um comportamento de fluxo de líquidos pseudoplástico e, também, a influência da concentração de EPS sobre a viscosidade aparente das soluções aquosas. A estirpe selvagem e todos os mutantes induziram a formação de nódulos em feijoeiro (fenótipo Fix+), sugerindo que os genes exoZ e phbAB não estão envolvidos nos processos de infecção e formação nodular mas, sendo necessários para a fixação biológica de nitrogênio / Abstract: Rhizobium tropici and other bacteria belonging to the order Rhizobiales are extracellular polysaccharides (EPS) producers, which possess the function of the receptor molecule to function as micro-symbiont, making an interaction cell / cell and triggering the nodulation process. The diversity of structures and chemical composition of EPS presented by molecules is reflected by the diversity of enzymes responsible for its synthesis. In this study, we sought to inactivation by insertional mutagenesis by "in vitro" transposition of genes from wild type exoZ Rhizobium tropici SEMIA 4080 involved in the synthesis of the EPS repeating subunits and phbAB tanden, responsible for synthesis of PHB, in order to obtain microrganisms with high mucosal aspect producer of EPS compared to wild type. The mutants showed mucous colonies when grown in culture media PsyA, demonstrating that mutant strains in genes exoZ and phbAB from rhizobia are able to form biofilm "in vitro", and to evaluate the relative efficiency in the production of EPS, the mutant 4080 Z03 showed the best result. For the three samples of EPS was possible to observe a flow behavior of pseudoplastic fluids, and also the influence of EPS concentration on the apparent viscosity of aqueous solutions. The wild type and mutants induced the formation of nodules in common bean (Fix+ phenotype), suggesting that genes exoZ and phbAB are not involved in the processes of infection and nodule formation, but are necessary for nitrogen fixation / Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Coorientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Regiane de Fátima Travensolo Sacomano / Banca: Simone Cristina Picchi / Banca: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Banca: Eliamar Aparecida Nascimbem Pedrinho / Doutor

Resumo: Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva e possui habilidade de produzir proteínas denominadas Cry ou delta-endotoxinas, durante a fase de esporulação. Estas proteínas são utilizadas no controle biológico de várias ordens de insetos. No entanto, pouco se conhece a respeito das vias metabólicas envolvidas na produção dessas proteínas, por exemplo, na natureza, é possível encontrar isolados que produzem grande quantidade de proteínas Cry, como também é possível encontrar outros isolados que produzem poucas quantidades. Considerando que essa diferença é devida a uma regulação gênica diferenciada entre isolados, a identificação dessa regulação pode levar a um incremento na produção de proteínas. Neste trabalho, foram analisados 10 clones mutantes comparados com o isolado selvagem (Bt1) quanto à mortalidade de lagartas neonatas de Spodoptera frugiperda considerando também a quantidade de proteínas Cry produzidas por estes mutantes. Os resultados demonstram que dois clones identificados como B9 e E2, demonstraram um bom controle dessas lagartas, mesmo aquelas que permaneceram vivas, ocorreu um atraso em seu desenvolvimento. Quanto à produção de proteínas, os clones apresentaram perfil protéico entre ~45 kDa e ~120 kDa, perfil característico encontrado entre estirpes ativas contra Lepidópteros. No entanto, os clones que apresentaram bons níveis de mortalidade (B9 e E2) mostraram somente a banda de ~65 kDa similar ao isolado selvagem, que pode ser a responsável pela sua ação inseticida. Os resultados obtidos demonstram a possibilidade de efetuar melhoramento genético em B. thuringiensis por meio de mutagênese mediada por transposon e abre caminho para o estudo das vias metabólicas envolvidas na produção de proteínas Cry. / Abstract: Bacillus is a gram-positive bacterium and produces internal crystal inclusions named crystal (Cry) proteins or d - endotoxins during the sporulation phase. These proteins as used to control several agriculture insect pests. However little is known concerning the metabolic pathways involved in the production of these proteins. For example, in nature, it is possible to find isolates that produce large quantities of the Cry proteins as well as it is possible to find ones that produce limited quantities. Since such difference might be related to gene regulation the identification of regulation factors found in these isolated should lead to an increment on the crystal protein production found in isolated naturally exhibiting lower production. In this work, ten mutant clones were analyzed compared to the wild type (Bt1) with respect to Spodoptera frugiperda neonatal larvae mortality considering also the amount of crystal protein produced by these mutants. The results have demonstrated that two mutant clones named B9 and E2 have produced strong control of these larvae; while at the same time eliciting a delay on the development of the ones that eventually did not dye at first. As for the Cry protein content, the cloned presented a protein profile ranging from ~45 kDa to ~120 kDa which is typical of Cry proteins acting on lepidopterans. The clones that have shown good mortality levels (B9 and E2) have exhibited only a protein band with ~65 kDa, similar to the one produced by the wild type strain, which might be related to its control activity. Finally, the results obtained seem to lead to the possibility of improving genetically B. thuringiensis using mutagenesis induced by transposon and at the same time might pave the way to the shed light on the study of metabolic pathways involved in the Cry proteins production. / Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Mestre

Orientador: Maria Aparecida Marin-Morales / Banca: Maria Luiza Silveira Mello / Banca: Cláudia Bueno dos Reis Martinez / Banca: Maria Angélica Maciel Martinho Ferreira / Banca: Edson Luis Maístro / Resumo: Os azocorantes são substâncias químicas extremamente utilizadas em indústrias têxteis que podem induzir mudanças no material genético de organismos expostos, mesmo que essas alterações no DNA não se expressem de imediato. Foram avaliadas as citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade de diferentes concentrações (1, 10, 100 e 1000 mg/L - na ausência dos microorganismos - e 50 e 200 mg/L - na presença dos microorganismos) do azocorante Black Dye Commercial Product (BDCP), antes e após tratamentos de biodegradação por diversos microrganismos (1. "Pool" de bactérias heterotróficas provenientes de uma estação de tratamento biológico de efluentes, 2. Levedura Candida viswanathii, e 3. Fungo Basidiomiceto Phanerochaete chrysosporium), por meio de diferentes técnicas citogenéticas (coloração convencional, bandamento C, bandamento RON, bandamento por fluorocromos base-específicos CMA/DAPI e hibridação in situ fluorescente - FISH) aplicadas sobre o organismo teste Allium cepa. Pela técnica citogenética de coloração convencional, foi possível verificar que o corante, com e sem ação microbiana, induziu apoptose, necrose, células micronucleadas, aberrações cromossômicas e alterações nucleares. As aberrações cromossômicas e alterações nucleares foram visualizadas em todos os estágios do ciclo celular: na intérfase foram observados brotos nucleares e células poliplóides; na prófase, perdas de material genético; na metáfase, aderências cromossômicas, perdas cromossômicas, C-metáfases e poliploidias; na anáfase e telófase, multipolaridades, pontes e perdas cromossômicas. Os brotos nucleares apareceram com maior freqüência nas células submetidas aos testes do azocorante tratado com microorganismos, sendo que esse tipo de alteração deve estar associado à presença dos metabólitos do corante. As freqüências de micronúcleos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Azo dyes are chemical substances extremely used by textile industries that may induce changes in the genetic material of exposed organisms, even if these changes in the DNA do not express themselves immediately. Cytotoxicity, genotoxicity and mutagenicity evaluations of the different azo dye (BDCP) concentrations were performed (1, 10, 100 e 1000 mg/L - without microorganisms - and 50 and 200 mg/L - with microorganisms), before and after biodegradation tests, using different microorganisms (1. Heterotrofic bacteria "pool" proceeding from an effluent biological treatment station, 2. Candida viswanathii - Yeast, and 3. Phanerochaete chrysosporium - Basidiomicet Fungi), by means the different cytogenetical assays (conventional staining, C-banding, RON-banding, CMA/DAPI banding and fluorescent in situ fluorescent hybridization), using Allium cepa as test organism. By the conventional staining cytogenetic assay, it was possible to verify that the azo dye induced apoptosis, necrosis, micronuclei, chromosome aberrations and nuclear alterations. The chromosome aberrations and nuclear alterations were visualized in all phases of the cell cycle: in the interphase were observed nuclear buds and polyploidizated cells; in the prophase were observed genetic material losses; in the metaphase were observed chromosome adherences, chromosome losses, C-metaphases and polyploid cells; and in the anaphase and telophase were observed multipolar cells, chromosome bridges and chromosome losses. The frequencies of nuclear buds were the higher when the cells had been submitted to the azodye treated with microorganisms, suggesting that this kind of alteration must be associated to the presence of the azodye metabolites. The micronuclei and chromosome breaks frequencies... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor