Depuis 2011, des mutations hétérozygotes germinales du gène GATA2 ont été identifiées chez des patients et familles, associées à des maladies hématologiques (myélodysplasie (MDS), leucémie aiguë myéloblastique (LAM)), immunologiques (déficit en cellules B, NK et monocytes (DMLC syndrome)) et vasculaires (syndrome d'Emberger, associant MDS et lymphœdème) 1-3. Le gène GATA2 code pour un facteur de transcription comportant 2 doigts de zinc, essentiel dans la régulation de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices et des cellules souches hématopoïétiques (CSH). De nombreuses mutations différentes du gène GATA2 ont été identifiées (mutations ponctuelles non-sens ou faux sens, larges délétions, délétions focales d'un enhancer dans l'intron 4) sans claire corrélation entre le génotype et le phénotype. Nous avons d'abord retrouvé, par séquençage des phases codantes (exome) au sein d'une famille de 4 patients suivis à Toulouse, une mutation GATA2 R396Q. Dans un second temps, l'analyse d'une cohorte nationale a permis d'identifier des patients porteurs de mutations GATA2 présentant des phénotypes cliniques de type DMLC, LAM et/ou MDS 4. Actuellement, plus de 80 patients ont été identifiés au niveau national. Au niveau fonctionnel, nous avons initié l'analyse de 2 mutations ayant des conséquences clairement distinctes : la mutation R204X qui conduit à un codon stop dans le domaine précédant le premier doigt de zinc et la mutation ponctuelle R396Q, faux sens, située à la fin du deuxième doigt de zinc. Les modèles de différenciation in vitro en milieu semi-solide à partir de progéniteurs hématopoïétiques transduits par un vecteur rétroviral ont montré que les cellules transduites avec le mutant R396Q restent bloquées à un stade précoce de différenciation granulo-monocytaire, confirmé par l'analyse cytologique (aspect de myéloblastes). Le mutant R204X ne montre aucun effet différentiel en comparaison des cellules transduites par GATA2 sauvage. Le mutant R396Q, à la différence du mutant R204X, peut induire une transformation leucémique des cellules in vitro lors de réensemencements sériels des progéniteurs transduits. Ces cellules peuvent être cultivées indéfiniment en milieu liquide sans cytokines, initiant une lignée leucémique. La localisation cellulaire de ces 2 protéines mutantes est distincte, nucléaire pour le mutant R396Q (identique à la protéine normale) et cytoplasmique pour le mutant R204X par perte probable du signal de localisation nucléaire. L'analyse transcriptomique a retrouvé un ensemble de gènes différentiellement exprimés entre le mutant R396Q et le gène sauvage. Différents modèles animaux sont développés. Deux modèles murins, un de reconstitution hématopoïétique après transduction et un modèle knock-in inductible, sont en cours. La première expérience de reconstitution hématopoïétique n'a pas permis de mettre en évidence de phénotype leucémique après 6 mois de suivi, par probable rétention intramédullaire et différenciation terminale des cellules transduites. Nous avons également initié une collaboration permettant d'analyser l'effet des mutations de GATA2 ou équivalents ontogéniques (serpent, pannier) dans la drosophile. Les protéines GATA sont ainsi très conservées au cours de l'évolution et dans la drosophile, les protéines de la famille GATA ont un rôle essentiel dans la différenciation du système hématopoïétique de cet animal. / Since 2011, heterozygous germline GATA2 mutations have been identified in patients and families associated with hematological (myelodysplasia (MDS), acute myelogenous leukemia (AML)), immunological (B cells, NK cells and monocytes deficiency (DMLC syndrome)) and vascular diseases (Emberger syndrome, combining MDS and lymphedema) 1-3. The GATA2 gene encodes a transcription factor containing two zinc fingers critical for the regulation of the proliferation and differentiation of progenitor and hematopoietic stem cells (HSCs). Many different GATA2 mutations were identified (nonsense or missense point mutations, large deletions, focal deletions of an enhancer in intron 4) without clear correlation between genotype and phenotype. We first identified a R396Q mutation of GATA2 by sequencing the coding frames (exome) of cells in a family of 4 patients followed in Toulouse. Then the analysis of a national cohort identified additional patients carrying GATA2 mutations with various clinical phenotypes such as DMLC, AML and/or MDS 4. Currently, over 80 patients have been identified at the national level. Functionally, we initiated the analysis of 2 specific mutations with very distinct consequences: R204X a mutation leading to a stop codon before the first zinc finger and the R396Q a missense mutation located at the end of the second zinc finger. In vitro differentiation in semi-solid medium of hematopoietic progenitors transduced with a retroviral vector have shown that the cells transduced with the mutant R396Q remain blocked at an early stage of granulo-monocytic differentiation confirmed by cytological analysis (myeloblasts). The R204X mutant shows no differential effect compared to cells transduced with wild type GATA2. The R396Q mutant, unlike the R204X, can induce leukemic transformation of cells in vitro after serial re-seeding of transduced progenitors. These cells may be grown in liquid media without cytokines indefinitely, initiating a leukemia cell line. The cellular localization of these two mutant proteins is distinct, nuclear for the R396Q mutant (identical to the wild type protein) and cytoplasmic for the R204X mutant by probable loss of the nuclear localization signal. Transcriptomic analyses have shown differential gene expression between R396Q mutant and the normal gene. Various animal models are developed. Two mice models, one of hematopoietic reconstitution after retroviral transduction and one inducible knock-in model, are ongoing. The first hematopoietic reconstitution experiment failed to demonstrate leukemic phenotype after 6 months of follow-up, likely by intramedullary retention and terminal differentiation of transduced cells. We have also initiated collaboration to analyze the effect of mutations of GATA2 or equivalent ontogenetic genes (serpent, pannier) in Drosophila. GATA proteins are very well conserved during evolution and in Drosophila, the GATA family proteins have a critical role in the differentiation of the hematopoietic system.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont un ensemble d’hémopathies clonales de la cellule souche. Ils touchent les sujets âgés et se caractérisent par une hématopoïèse inefficace, une différenciation anormale et une transformation fréquente en leucémie aiguë myéloblastique (LAM). La prise en charge thérapeutique a considérablement évolué ces dix dernières années, principalement avec l’arrivée de la 5-azacytidine (Aza) dans les SMD de haut risque. Malheureusement, il existe fréquemment un échec ou une perte de réponse rapide au traitement responsable d’une survie médiane globale de seulement quelques mois. La compréhension des mécanismes d’action des agents hypométhylants, la mise en évidence des facteurs biologiques impliqués dans la résistance à l’Aza ou encore l’identification de nouvelles associations de molécules constitue donc un enjeu majeur. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont démontré que l’erlotinib (Erlo) (inhibiteur de l’activité kinase de l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)) possède des effets antinéoplasiques dans les SMD/LAM. Compte tenu de sa toxicité modérée, cet inhibiteur de tyrosine kinase est actuellement en essai clinique en France et aux États-Unis dans les SMD en échec d’Aza. Dans ce travail, nous avons tenté de comprendre les mécanismes d’action impliqués dans l’activité de l’Aza et de l’Erlo seuls ou en association. Nous avons observé que l’Aza et la décitabine (un autre agent hypométhylant) induisent la déphosphorylation et la translocation dans le noyau du facteur de transcription FOXO3A où il réactive l’expression de gènes cibles tels que les facteurs pro apoptotiques PUMA et BIM. Cet effet observé rapidement, suggère un effet « off target » non lié à une reprogrammation épigénétique. La phosphorylation constitutive de FOXO3A étant considérée comme un facteur de mauvais pronostic dans les LAM, cette observation soulève l’intérêt potentiel des agents hypométhylants dans cette pathologie. Nous avons également identifié deux nouvelles cibles de l’Erlo : les SRC-kinases et la voie mTOR/p70S6K dont l’inhibition par des inhibiteurs biochimiques induit un arrêt du cycle cellulaire en G0/G1 sans apoptose ni différenciation confirmant l’hypothèse d’une action « multikinase » de l’Erlo. Par ailleurs, nous avons mis en évidence une activité synergique sur l’apoptose de l’association Aza et Erlo sur des lignées cellulaires de SMD/LAM et sur des cellules de patients. Cet effet n’a pas été retrouvé avec la décitabine ni les autres inhibiteurs de tyrosine kinase testés. La potentialisation de l’apoptose semble liée à plusieurs mécanismes associant l’augmentation de la concentration intracellulaire d’Aza via l’inhibition des transporteurs ABC, un arrêt de la prolifération, une activation des voies apoptotiques caspases-dépendantes et indépendantes et une activation des dommages à l’ADN. En conclusion, ce travail a permis l’identification de nouvelles cibles de l’Erlo et de l’AZA et a révélé un effet synergique entre ces deux molécules. Ces résultats précliniques encourageants suggèrent que cette association pourrait apporter un potentiel bénéfice chez les patients atteints de SMD/LAM, notamment ceux devenus réfractaires à l’Aza. / Myelodysplasic syndromes (MDS) constitute a diverse group of malignant clonal disorders that typically occur in elderly people. MDS are characterized by ineffective hematopoiesis, refractory cytopenias, morphologic dysplasia and increased potential to transform into acute myeloid leukemia (AML). Treatment of MDS has progressed considerably in recent years with the emergence of new approval agents such as azacytidine (aza)(a hypomethylating agent (HMA)) in higher-risk MDS. However, there are still a significant proportion of patients who do not respond to therapy with aza. Therefore, understanding the mechanisms of action of HMAs, identifying predictive factors for aza resistance and combining HMAs with other active compounds in MDS represent a challenging area to improve MDS/AML treatment. Previous works showed that erlotinib (an inhibitor of the epidermal growth factor receptor (EGFR)) exhibits antineoplastic effects in MDS/AML. Due to its limited toxicity profile, this tyrosine kinase inhibitor is currently being evaluated after failure of aza in two clinical trials. In this project, we aimed at understanding the molecular mechanisms involved in the activity of aza and erlo alone or in combination. We observed that aza and decitabine (another HMA related to aza) induces dephosphorylation and translocation to nucleus of the transcriptional regulator FOXO3A promoting the upregulation of the pro-apoptotic factors PUMA and BIM. This effect could be an “off target” effect and could contribute the bebenfical role of HMA in AML as constitutive phosphorylation of FOXO3A has been shown to be an adverse prognostic factor. We discovered new target for erlo, Src-kinase kinases and mTOR that are implicated in the cell-cycle arrest but not in the induction of apoptosis or differentiation confirming the “multikinase” activity of erlo. We found that the combination of aza and erlo demonstrated synergistic induction of apoptosis in MDS/AML cell lines and in some patient cells. This effect was not observed with decitabine or other tyrosine kinase inhibitors frequently used in onco-hematology. We demonstrated that potentiation of cell death is associated with different mechanisms such as intracellular accumulation of aza (via inhibition of ABC transporters), cell cycle arrest with inhibition of leukemic cells growth, caspase-dependent and -independent induction of apoptosis and DNA damage level. In conclusion, this work identified new targets of aza and erlo and revealed a synergistic induction of apoptosis upon co-treatment suggesting that this drug combination might be promising for SMD/AML treatment SMD/AML, especially the resistant patients.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) avec dysplasie, identifiées par la classification OMS 2008 sous le nom de LAM-MRC (« AML with myelodysplasia-related changes »), sont actuellement définies par la présence de critères cliniques, cytologiques et cytogénétiques. Elles forment un groupe hétérogène tant sur le plan biologique que pronostique. Nous avons fait l'hypothèse que la caractérisation moléculaire des LAM-MRC pourrait permettre d'identifier des marqueurs spécifiques associés à ces pathologies et d'en distinguer différents sous-groupes. Nous avons mis en évidence que les LAM-MRC de risque cytogénétique intermédiaire présentent un profil mutationnel spécifique caractérisé par un taux élevé de mutation d'ASXL1 et une faible proportion de mutations de DNMT3A, NPM1 et FLT3. Les LAM-MRC de risque cytogénétique défavorable, essentiellement complexes et/ou monosomales, sont quant à elle associées aux mutations de TP53. Alors que les critères actuels des LAM-MRC ne permettent pas d'en stratifier le pronostic, nous avons montré que les mutations d'ASXL1 ou de TP53 sont des facteurs pronostics péjoratifs majeurs. Ainsi, une reclassification basée sur la présence de ces altérations moléculaires exclusives entre elles permettrait d'affiner le diagnostic et la stratification pronostique de ces maladies. Enfin, dans une stratégie de médecine personnalisée combinant le séquençage à haut débit à des tests de sensibilité thérapeutique in vitro, l'identification de tels marqueurs moléculaires permettraient de prédire la réponse aux traitements, de guider les choix thérapeutiques et d'orienter le développement de nouvelles drogues. / Acute myeloid leukemia (AML) with myelodysplasia-related changes (AML-MRC) as reported in the WHO 2008 classification are defined by the presence of clinical, morphological and cytogenetic criteria. AML-MRCs are heterogeneous diseases with prognostic heterogeneity. We hypothesized that molecular characterization of AML-MRC could identify specific molecular markers and disease subgroups. We showed that AML-MRCs with intermediate cytogenetic risk harbor a specific mutational profile characterized by a high frequency of ASXL1 mutations and a low incidence of DNMT3A, NPM1 and FLT3 mutations. Unfavorable cytogenetic risk AML-MRCs, especially due to complex and/or monosomal karyotypes, are associated with TP53 mutations. While WHO criteria do not stratify the prognosis of AML-MRC patients, we showed that the mutations of ASXL1 or TP53 are major poor prognostic factors. The criteria defining AML-MRC do not identify distinct clinical and biological subgroups and do not predict outcome of patients with AML-MRC. In contrast, ASXL1 and TP53-mutated AML identify two distinct biological subgroups of AML-MRC with very poor outcome. This molecular characterization could be useful to redefine AML-MRC in a future classification aiming at merging biological characterization and specific prognostic value. Finally, we showed that a personalized treatment approach combining next generation sequencing and in vitro drug screening could be useful to predict therapeutic response and to guide both treatment choices and new targeted drug developments.