NADPH-cytochrome P450 reductase is the electron transfer partner for the cytochromes P450, heme oxygenase, and squalene monooxygenase, and is a component of the nitric oxide synthases and methionine synthase reductase. P450 reductase shows very high selectivity for NADPH and uses NADH only poorly. Substitution of tryptophan 677 with alanine (W677A) has been shown by others to yield a 3-fold increase in turnover with NADH, but profound inhibition by NADP+ makes the enzyme unsuitable for in vivo applications. In the present study site-directed mutagenesis of amino acids in the 2'-phosphate-binding site of the NADPH domain, coupled with the W677A substitution, was used to generate a reductase that was able to use NADH efficiently in vivo without inhibition by NADP+. Of 11 single, double, and triple mutant proteins, two (R597M/W677A and R597M/K602W/W677A) showed up to a 500-fold increase in catalytic efficiency (kcat/Km) with NADH. Inhibition by NADP+ was reduced by up to four orders of magnitude relative to the W677A protein and was equal to or less than that of the wild-type reductase. Both proteins were 2- to 3-fold more active than wild-type reductase with NADH in reconstitution assays with cytochrome P450 1A2 and with squalene monooxygenase. In a recombinant cytochrome P450 2E1 Ames bacterial mutagenicity assay the R597M/W677A protein increased the sensitivity to dimethylnitrosamine by approximately 2-fold, suggesting that the ability to use NADH afforded a significant advantage in this in vivo assay. In addition to providing a valuable tool for understanding the determinants of nucleotide cofactor specificity in this and related enzymes, these mutants might also lend themselves to creation of bioremediation schemes with increased enzymatic activity and robustness in situ, as well as cost-effective reconstitution of enzyme systems in vitro that do not require the use of expensive reducing equivalents from NADPH.

La NADPH cytochrome P450 réductase (CPR) est une flavoprotéine multidomaines appartenant à la famille des diflavines réductases et un des composants essentiels du système redox des cytochromes P450. La CPR est formée de deux domaines catalytiques contenant des groupements prosthétiques FAD et FMN et d'un domaine de connexion. Le domaine FAD reçoit deux électrons du NADPH et les transfère un par un au domaine FMN, qui, à son tour, les transfère aux accepteurs. Le transfert d’électron du FMN vers les accepteurs nécessite un déplacement du domaine FMN par rapport au reste de la molécule. Au fils des années, les études structurales menées sur la CPR ont mis en évidence la réorganisation structurale et l’arrangement des domaines dans cette protéine. Cependant, les résultats de ces analyses ne fournissent pas d’informations concernant la vitesse à laquelle les mouvements des domaines de la CPR s’effectuent et n’incluent toujours pas les paramètres qui induisent le changement conformationnel ainsi que l'influence de ces changements sur l’activité catalytique de la CPR.Le projet de cette thèse a consisté à apporter de nouveaux éléments de compréhension sur la relation entre les changements conformationnels de la CPR et son cycle catalytique. La première partie de ce travail a porté sur le développement de stratégies de préparation au marquage des domaines catalytiques de la CPR, destinés à l’étude dynamique de cette protéine par le FRET. Différentes stratégies ont été envisagées parmi lesquelles l’incorporation de p-acétyle phénylalanine sur des positions définies dans la CPR. La deuxième partie de ce travail est consacrée à l’étude dynamique de la CPR via des techniques de RMN et SAXS combinées à des approches biochimiques. Les expériences menées ont permis de caractériser en solution et en absence de NaCl, la présence d’un état rigide, globulaire en conformation fermée dans laquelle les domaines FMN et FAD sont maintenus « verrouillés » par des interactions à l’interface entre ces deux domaines. L’augmentation de la concentration en NaCl permet une transition de cet état « verrouillé » vers un état plus ouvert pour lequel il n’y a plus d’interface entre les domaines FAD et FMN. L’état « déverrouillé » de la CPR correspond à un équilibre dynamique entre un ensemble de conformations en échange rapide. Cet équilibre est contrôlé par la force ionique et l’activité catalytique de la CPR est maximale lorsque les états verrouillés et déverrouillés sont également peuplés. Le modèle cinétique proposé par nos études a permis de mettre en évidence un lien direct entre la dynamique des domaines et l’activité du transfert d’électron au cours de cycle catalytique de la CPR. / NADPH cytochrome P450 reductase (CPR) is a multidomain flavoprotein that belongs to the diflavines reductase family. It is an essential component of redox system delivering electrons for cytochrome P450. CPR is composed of two catalytic domains containing FAD and FMN prosthetic groups and a connecting domain. FAD domain receives two electrons from NADPH and transfers them one by one to the FMN domain, which in turn transfers them to the acceptor. The electron transfer from FMN to the acceptor requires a large domain movement. Over the years, structural studies of CPR have highlighted the reorganization and arrangement of domains in this protein. However, the results of these analyses do not provide any information about how fast the domains movements takes place in CPR, and do not always include the parameters that induce conformational change as well as influence of those changes on the catalytic activity of the CPR. This thesis aims to bring new elements of comprehension on the relationship between conformational changes in CPR and its catalytic cycle. The first part of the work concerned the development of strategies to label the catalytic domains of CPR, a prerequisite for the dynamic study of this protein by FRET. Different strategies have been proposed including the incorporation of p-acetyl phenylalanine at defined positions in CPR. The second part of this work is devoted to the dynamic study of CPR through a combined SAXS, NMR and biochemical approaches. The experiments conducted allowed to characterize the presence of a rigid and globular state of closed conformation for CPR, in solution and in the absence of NaCl. In this conformation the FMN and FAD domains are kept "locked" by interface interactions between these two domains. Increasing the NaCl concentration permits the transition from the "locked" stats to an open conformation in which there is no more interface between the FAD and FMN domains. The "unlocked" state of CPR is a dynamic equilibrium between ensembles of conformations in fast exchange. This equilibrium is controlled by the ionic strength and CPR presents its maximum catalytic activity when the locked and unlocked states are equally populated. We proposed a kinetic model which allows demonstrating a direct link between the domain movement and electron transfer activity during the catalytic cycle of CPR.