L'objectif de notre travail est de comprendre la contribution relative des voies de signalisation précoces du TCR et de CD28 dans l'activation des lymphocytes T naïfs. Notre étude a d'abord montré que dans les cellules T CD4+ naïves, la stimulation du TCR augmente de manière significative la liaison en deux dimensions (2D) de CD28 avec ses ligands B7, et ceci dépend à la fois du domaine cytoplasmique de CD28 et de l'activité des src kinases. Par la suite, notre analyse biochimique a démontré que l'engagement du TCR par son ligand (CMHp) potentialise la phosphorylation de CD28 stimulée par son ligand B7. En outre, la stimulation conjointe du TCR et de CD28 augmente fortement la phosphorylation des protéines de signalisation proximales telles que les molécules Vav-1 et PLCγ-1. Nous avons également examiné la mobilisation des ions calcique (Ca++). Nous avons trouvé que l'engagement du TCR ou de CD28 seul est capable de déclencher une élévation de la concentration intracellulaire d'ions Ca++ dans des cellules T naïves. Cette élévation qui se caractérise par de fortes fluctuations de la concentration calcique impliquerait principalement 2 types de canaux calciques de la membrane plasmique. De façon attendue, une stimulation conjointe des lymphocytes par le TCR et CD28 augmente l'amplitude moyenne de la réponse calcique. Nos données ont révélé que seule une stimulation conjointe, et non individuelle, du TCR et de CD28 augmente significativement le temps de résidence du Ca++ libres fluctuants par rapport aux cellules non stimulées. Par conséquent, cette augmentation du temps de résidence caractérise spécifiquement la réponse calcique induite par TCR et CD28. / In this work, we aimed at determining the relationship between and specific contribution of TCR and CD28 early signaling pathways in naïve CD4+ T cell activation. Our data showed that in naïve CD4+ T cells, TCR stimulation significantly increased the 2D binding of CD28 to its B7 ligands and this increase depended on both cytoplasmic tail of CD28 and activity of src kinases. Our biochemical analysis then demonstrated that TCR engagement with its ligand pMHC strongly enhanced the CD28 tyrosine phosphorylation triggered by B7. Moreover, the conjoint stimulation of TCR and CD28 markedly augmented activation of proximal signaling molecules such like Vav-1 and PLCγ-1 compared to the stimulation with each receptor alone. We next went to examine the calcium ion (Ca2+) mobilization. We found that in naïve CD4+ T cells, engagement with ligand of TCR or CD28 alone was able to trigger rise of the fluctuating cytosolic-free Ca2+ level. Unexpectedly, such rises implicated predominantly the involvements of two different types of calcium channels: Cav and CRAC channels. The conjoint stimulation with both TCR and CD28 enabled the augment of average amplitude of the calcium response. Through the time series analysis, our data unveiled that the conjoint, but not separate, TCR and CD28 stimulation in naïve CD4+ T cells significantly increased the fluctuating cytosolic-free Ca2+ dwell time relative to that found in unstimulated cells. The increase of the cytosolic-free Ca2+ dwell time therefore uniquely characterized the calcium response triggered by TCR and CD28 and presumably corresponded to a fundamental feature for the high efficiency of T cell activation induction.

La survie des cellules T naïves est essentielle au bon fonctionnement du système immunitaire à long terme. Les rats BBDP (Bio-breeding Diabetes prone) sont caractérisés par une haute prédisposition au développement du diabète ainsi que par une diminution significative du nombre de cellules T naïves. Ces rats comportent une mutation de type décalage de lecture dans le gène codant pour «GTPase Immunity-Associated Protein 5» (Gimap5) ce qui entraine l’apoptose des lymphocytes T. Le mécanisme par lequel la déficience de la protéine GIMAP5 conduit les cellules T à la mort est actuellement méconnu. GIMAP5 a également été associée à différentes maladies auto-immunes, ce qui suggère son influence dans l'homéostasie des lymphocytes T. Des résultats antérieurs de notre groupe de recherche ont montré que l'absence de GIMAP5 entraîne une diminution du flux de Ca2+ ainsi qu’une réduction de la capacité mitochondriale à emmagasiner du Ca2+ suite à la stimulation du TCR. Cependant, GIMAP5 n'est pas une protéine mitochondriale. Afin de mieux comprendre le rôle de GIMAP5 dans la biologie des cellules T, au cours de mes études doctorales, je me suis concentré sur la localisation cellulaire de la protéine ainsi que sur son rôle dans l'homéostasie du Ca2+. Comme modèle d’étude, j'ai établi des lignées cellulaires HEK293T stables pour l’expression de GIMAP5, ainsi que pour différents mutants et variantes de la protéine. Ceci m’a permis d’élucider l'importance du domaine transmembranaire (TM) pour la localisation et le rôle physiologique de GIMAP5 ainsi que la différence entre les deux variantes de cette protéine. Mes résultats ont permis de montrer que l'expression de Gimap5 ne semble pas être nécessaire après l’activation des lymphocytes T. En parallèle, j'ai confirmé nos observations antérieures qui démontrent l’influence de GIMAP5 dans l'homéostasie du Ca2+ et sa colocalization avec les microtubules. En outre, j'ai montré que GIMAP5 se trouve dans des structures de type vésiculaire, particulièrement dans la membrane lysosomale où son domaine TM est essentiel à son bon fonctionnement et localisation. Mes résultats suggèrent que les mitochondries exhibent un défaut dans leur capacité à emmagasiner du Ca2+ au niveau basal, ainsi que suite à l’activation du TCR. Enfin, j'ai démontré pour la première fois, que l'influence de GIMAP5 sur le stockage de Ca2+ lysosomal peut avoir un impact sur la survie des lymphocytes T. D’après ces observations, une des fonctions probables de GIMAP5 serait d’empêcher la fermeture prématurée des canaux de relâche calcique. Finalement, GIMAP5 pourrait être engagé dans des mécanismes visant à prolonger et raffiner la signalisation du Ca2+ dans les cellules T. Bref, la régulation du Ca2+ lysosomal médié par GIMAP5 est essentielle à la survie de cellules T naïves. / Abstract: Healthy and long-term survival of naïve T cells is essential for proper functioning of the immune system. In bio-breeding diabetes prone (BBDP) rats, there is a critical decrease in the number of naïve T cells. In these rats, a recessive frameshift mutation in the GTPase of Immune-Associated Protein 5 (Gimap5) gene induces lymphocytes to undergo spontaneous apoptosis. The death of T cells driven by a deficiency of the GIMAP5 is currently not fully understood. Interestingly, different autoimmune diseases have shown an association with perturbations in the Gimap5 gene, which further suggests its influence in basal lymphocyte homeostasis. Previous findings by our group have shown that the absence of GIMAP5 results in a decrease calcium flux following TCR stimulation and an impaired capacity of the mitochondria to buffer calcium entry. However, GIMAP5 is not a mitochondrial protein. During my Ph.D. studies, I focused on clarifying the cellular localization of GIMAP5 as well as its function in Ca2+ homeostasis in order to further understand its role in T cell biology. As a model, I established HEK293T cells stable for the expression of the different mutants and variants of the GIMAP5 protein. Where I uncovered the importance of the transmembrane domain (TM) for GIMAP5 localization and physiological role, as well as the differences between the two variants of GIMAP5. The results obtained show that the expression of Gimap5 is no longer needed after T cells activation. Moreover, our previous observations were confirmed and expanded upon regarding GIMAP5’s influence on Ca2+ homeostasis and colocalization with the cytoskeleton. It was also shown that GIMAP5 localizes to vesicular-like structures, particularly to the lysosomal membrane, where its TM domain is critical for proper functioning and localization. My results suggest that the mitochondria might be impaired to uptake as well as retain Ca2+ at their full capacity in the absence of GIMAP5. Finally, I observed for the first time that GIMAP5’s influence on lysosomal Ca2+ storage could impact lymphocyte survival. These results suggest that GIMAP5 may work as a backup mechanism to prevent premature closure of Ca2+ channels and Ca2+ influx or as a mechanism to prolong and refine Ca2+ signaling in T cells.