[ES] La presente tesis doctoral, titulada "papel del miR-99a-5p en cáncer de mama: transformando hallazgos moleculares en herramientas clínicas" está centrada en el estudio del microRNA miR-99a-5p en cáncer de mama y en la determinación de su potencial como diana terapéutica y biomarcador para el diagnóstico de dicha enfermedad. En el primer capítulo, se lleva a cabo una revisión general del cáncer de mama y los microRNAs. A continuación, en el segundo capítulo se presentan los objetivos. En el tercer capítulo se compararon los perfiles de expresión de microRNAs de una línea celular de cáncer de mama resistente a doxorrubicina frente a la línea celular parental, dando lugar a la identificación del microRNA miR-99a-5p como el más desregulado entre ambas. A continuación, se confirmó que el miR-99a-5p aumenta la sensibilidad a doxorrubicina mediante la inhibición directa de la expresión de COX-2, que conlleva la inhibición de la expresión de la proteína ABCG2, ampliamente descrita por su papel en resistencia a fármacos. En base a los resultados obtenidos, se diseñaron nanodispositivos basados en nanopartículas mesoporosas de sílice para la liberación de miR-99a-5p y doxorrubicina en los tumores. Se confirmó la eficacia de las nanopartículas para reducir el crecimiento tumoral así como los efectos adversos asociados a la doxorrubicina libre en un modelo ortotópico murino de cáncer de mama. En el cuarto capítulo, se evaluó el potencial del miR-99a-5p como biomarcador para el diagnóstico del cáncer de mama. Se determinó la expresión del microRNA en tumores primarios de cáncer de mama y en tejidos sanos. Los resultados mostraron que el miR-99a-5p se encuentra infraexpresado en los tejidos cancerosos. A continuación, con el objeto de determinar el potencial del miR-99a-5p como biomarcador mínimamente invasivo, se determinaron los niveles de expresión en plasma de pacientes de cáncer de mama y de donantes sanos. Se encontró que el miR-99a-5p se encuentra a mayor concentración en el plasma de pacientes con cáncer de mama. Estos resultados se validaron en una cohorte independiente. Mediante el análisis en base a curvas ROC se confirmó que el miR-99a-5p es útil como biomarcador no invasivo para el diagnóstico del cáncer de mama incluso en estadíos tempranos de la enfermedad. El quinto capítulo se centra el diseño y validación de un biosensor basado en soportes de alúmina mesoporosa para la detección del miR-99a-5p en plasma. Los poros de una placa de alúmina mesoporosa se cargaron con el fluoróforo rodamina B, y se utilizaron oligonucleótidos complementarios a la secuencia del miR-99a-5p como puertas moleculares capaces de retener los fluoróforos en el interior de los poros. En presencia del miR-99a-5p, se produce liberación de rodamina B, que es posteriormente detectada ópticamente. Se confirmó la especificidad del biosensor, así como su alta sensibilidad. Además, utilizando muestras de plasma de pacientes de cáncer de mama y controles sanos, se confirmó la eficiencia del dispositivo para detectar cáncer de mama incluso en estadíos tempranos. Por último, en los capítulos cinco y seis se presentan la discusión general y las conclusiones principales extraídas. En conclusión, esta tesis doctoral demuestra que el miR-99a-5p tiene potencial como diana terapéutica y biomarcador para el cáncer de mama, y podría ser útil para mejorar el pronóstico de los pacientes con dicha enfermedad. Se ha elucidado que uno de los mecanismos por los que el miR-99a-5p está involucrado en sensibilidad a doxorrubicina es mediante la regulación del eje COX-2/ABCG2. Además, las nanopartículas diseñadas para la administración combinada de miR-99a-5p y doxorrubicina se presentan como una herramienta con gran potencial para el tratamiento oncológico. Por último, aprovechando el potencial del miR-99a-5p como biomarcador diagnóstico, se ha desarrollado un sistema de detección que podría ser una herramienta útil para mejorar la detección temprana del cáncer de mama. / [CA] La present tesis doctoral, titulada "paper del miR-99a-5p en càncer de mama: transformant descobriments moleculars en eines clíniques" està centrada en l'estudi del microRNA miR-99a-5p en càncer de mama i en la determinació del seu potencial com a diana terapèutica i biomarcador per al diagnòstic d'aquesta malaltia. En el primer capítol, es du a terme una revisió general del càncer de mama i els microRNAs. A continuació, en el segon capítol es presenten els objectius. En el tercer capítol es van comparar els perfils d'expressió de microRNAs d'una línia cel·lular de càncer de mama resistent a doxorrubicina amb la seua línia parental, donant lloc a la identificació del microRNA miR-99a-5p com el més desregulat entre ambdues. A continuació, es va confirmar que el miR-99a-5p augmenta la sensibilitat al fàrmac mijançant la inhibició directa de l'expressió de COX-2 de forma directa, que comporta la inhibició de l'expressió de la proteïna ABCG2 que està àmpliament descrita pel seu paper en resistència a fàrmacs. Basant-se en els resultats obtinguts, es van dissenyar nanodispositius basats en nanopartícules mesoporoses de sílice per a l'alliberament d'una combinació de miR-99a-5p i doxorrubicina en els tumors. L'eficacia dels sistemes per a reduir el creixement tumoral així com els efectes adversos associats a la doxorrubicina lliure es va confirmar en un model ortotòpic murí de càncer de mama. En el quart capítol, es va avaluar el potencial del miR-99a-5p com a biomarcador per al diagnòstic del càncer de mama. Es va determinar l'expressió del microRNA en tumors primaris de càncer de mama i en teixits sans. Els resultats van mostrar que el miR-99a-5p es troba infraexpressat en els teixits cancerosos. A continuació, amb l'objectiu de determinar el potencial del miR-99a-5p com a biomarcador mínimament invasiu, es van determinar els nivells d'expressió en plasma de pacients de càncer de mama i de donants sans. Es va trobar que el miR-99a-5p es troba a major concentració en el plasma de pacients amb càncer de mama. Aquestos resultats es van validar en una cohort independent. Per mitjà de l'anàlisi basant-se en corbes ROC es va confirmar que el miR-99a-5p és útil com a biomarcador no invasiu per al diagnòstic del càncer de mama inclús en estadis primerencs de la malaltia. El quint capítol es centra en el disseny i validació d'un biosensor basat en suports d'alúmina nanoporosa per la detecció del miR-99a-5p en plasma. Els porus d'una placa d'alúmina es van carregar amb l'indicador fluorescent rodamina B, i es van utilitzar oligonucleòtids complementaris a la seqüència del miR-99a-5p com a portes moleculars amb la capacitat de retindre els fluoròfors a l'interior dels porus. En presència del miR-99a-5p, es produeix l'alliberament de rodamina B, que serà posteriorment detectada òpticament. Es va confirmar l'especificitat del biosensor, així com la seua alta sensibilitat. A més, utilitzant mostres de plasma de pacients de càncer de mama i controls sans, es va confirmar l'eficiència del dispositiu per a detectar càncer de mama inclús en estadis primerencs. Finalment, en els capítols sis i set es presenten la discussió general i les conclusions principals. En conclusió, aquesta tesi doctoral demostra que el miR-99a-5p té potencial com a diana terapèutica i biomarcador per al càncer de mama, i podria ser útil per a millorar el pronòstic dels pacients amb dita malaltia. S'ha elucidat que un dels mecanismes pels quals el miR-99a-5p està involucrat en sensibilitat a doxorrubicina és per mitjà de la regulació de l'eix COX-2/ABCG2. A més, les nanopartícules dissenyades per a l'administració combinada de miR-99a-5p i doxorrubicina es presenta com una ferramenta amb gran potencial per al tractament oncològic. Finalment, aprofitant el potencial del miR-99a-5p com a biomarcador diagnòstic, s'ha desenvolupat un sistema de detecció que podria ser una ferramenta útil per a millorar la detecció primerenca del càncer de mama. / [EN] This PhD thesis, entitled "Role of miR-99a-5p in breast cancer: translating molecular findings into clinical tools" is focused on the study of the microRNA miR-99a-5p in breast cancer and in determining its potential as a therapeutic target and biomarker for the diagnosis of this disease. In the first chapter, a general review of breast cancer is carried out and microRNAs are also introduced. Next, in the second chapter, the objectives are detailed. In the third chapter, the microRNA expression profile of a doxorubicin-resistant breast cancer cell line was compared with its parental cell line, leading to the identification of the microRNA miR-99a-5p as the most deregulated between the two of them. Subsequently, it was confirmed that miR-99a-5p increases drug sensitivity through directly targeting COX-2, which leads to the inhibition of the expression of the ABCG2 protein, widely described to be involved in drug resistance. Based on the obtained results, nanodevices based on mesoporous silica nanoparticles were designed for the combined release of miR-99a-5p and doxorubicin in tumors. The ability of the systems to specifically target the CD44 receptor, which is overexpressed in breast cancer tumors, as well as to release the cargo specifically after internalization, were tested in vitro. Furthermore, the efficacy of the nanoparticles to reduce tumor growth and the adverse effects associated with free doxorubicin was confirmed in a murine orthotopic model of breast cancer. In the fourth chapter, the potential of miR-99a-5p as a biomarker for the diagnosis of breast cancer was evaluated. First, microRNA expression was determined in primary breast cancer tumors and compared with healthy tissues. The results showed that miR-99a-5p is downregulated in breast cancer tissues. Next, to determine the potential of the microRNA as a minimally invasive biomarker, the expression levels of miR-99a-5p in plasma of breast cancer patients and healthy donors were determined. In this case, it was found that miR-99a-5p is at higher concentrations in the plasma of breast cancer patients. These results were validated in an independent cohort. Through the ROC curve analysis, it was confirmed that miR-99a-5p is useful as a non-invasive biomarker for the diagnosis of breast cancer even at early stages. The fifth chapter focus on the design and validation of a biosensor based on nanoporous alumina supports for the detection of miR-99a-5p in plasma. The pores of the alumina plate were loaded with the fluorescent indicator rhodamine B, and oligonucleotides with a sequence complementary to the miR-99a-5p were used as molecular gates able to maintain fluorophores inside the pores. In the presence of miR-99a-5p, the capping oligonucleotide is displaced, leading to the opening of the pores and the release of rhodamine B, which is subsequently optically detected. The specificity and high sensitivity of the biosensor were confirmed. Furthermore, the efficiency of the device to detect breast cancer even at early stages was confirmed using plasma samples from breast cancer patients and healthy controls. Finally, chapters five and six present the general discussion and conclusions. In conclusion, this PhD thesis demonstrates that miR-99a-5p is a molecule with potential as a therapeutic target and biomarker for breast cancer, and it could be useful to improve the prognosis of patients. It has been elucidated that one of the mechanisms by which miR-99a-5p is involved in doxorubicin sensitivity is through the regulation of the COX-2/ABCG2 axis. Furthermore, nanoparticles designed for the combined administration of miR-99a-5p and doxorubicin are presented as a tool with great potential for cancer treatment and could be useful for the administration of microRNAs as therapy. Finally, taking advantage of the potential of miR-99a-5p as a diagnostic biomarker, a detection system has been developed and could be a useful tool to improve early detection of breast cancer. / This work was supported by, CIBERONC (CB16/12/00481), CIBER-BBN (CB07/01/2012), Spanish Government PI18/01219 (ISCIII), project RTI2018- 100910-B-C41 (MCUI/AEI/FEDER, UE) and the Generalitat Valenciana (PROMETEO/2018/024) for support. IG-C was funded by Generalitat Valenciana (ACIF/2016/030). LP was funded by Ministerio de Economia, Industria y Competitividad (FPI grant). SS was funded by Instituto de Salud Carlos III and the European Social Fund for the financial support “Sara Borrell” (CD16/000237). JMC was funded by Sociedad Española de Oncología Médica (Río Hortega-SEOM. The authors would like to thank the INCLIVA Biobank (PT17/0015/0049; B.000768 ISCIII) and the Valencian Biobanking Network integrated into the Spanish National Biobanks Network for providing the human biological samples. We would also like to thank the plasma donors and the nursing staff that accepted to participate in this study. / Garrido Cano, I. (2021). Role of miR-99a-5p in breast cancer: Translating molecular findings into clinical tools [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/180358 / TESIS

[ES] La presente tesis doctoral titulada "Reconocimiento de neurotransmisores basado en nanopartículas de oro y de sílice mesoporosa para aplicaciones de detección y liberación controlada" es una tesis realizada por compendio de artículos la cual se centra en el diseño, preparación, caracterización y evaluación de distintos nanodispositivos para la detección colorimétrica de neurotransmisores y sistemas de liberación controlada que responden a neurotransmisores basados en nanopartículas de oro y nanopartículas de sílice mesoporosa, equipadas con ligandos orgánicos, efectores enzimáticos, puertas moleculares y especies cromofluorogénicas o medicamentos. En el primer capítulo se introduce una visión general de lo que son los neurotransmisores, sus principales características y el importante papel que éstos desempeñan en el funcionamiento de nuestro organismo. Además, se presenta una descripción general de las propiedades y potenciales aplicaciones de las nanopartículas de oro funcionalizadas con ligandos orgánicos como sistemas de detección y las nanopartículas mesoporosas de sílice funcionalizadas con puertas moleculares como sistemas de liberación controlada. A continuación, en el segundo capítulo se presentan los objetivos generales que son abordados en los siguientes capítulos experimentales. En el tercer capítulo, se presentan tres sistemas de detección colorimétrica de neurotransmisores basados en la agregación de nanopartículas de oro doblemente funcionalizadas con ligandos orgánicos. El primer sistema es un sensor capaz de detectar de forma selectiva el neurotransmisor serotonina, utilizando nanopartículas de oro funcionalizadas con ditio-bis(propionato de succinimidilo) y N-Acetil-L-Cisteína. El segundo sistema consiste en un sensor para la detección selectiva del neurotransmisor norepinefrina diseñado a partir de nanopartículas de oro funcionalizadas con 4-(liponiloxi)benzaldehído y ácido 4-mercato fenilborónico. El tercer sistema está compuesto por nanopartículas de oro funcionalizadas con 4-(liponiloxi)benzaldehído y N-Acetil-L-Cisteína, para la detección de normetanefrina, un importante biomarcador del tumor feocromocitoma. Todos estos sistemas se evalúan en medios competitivos como suero sanguíneo u orina. En el cuarto capítulo se muestran dos sistemas de liberación controlados enzimáticamente basados en la apertura de puertas moleculares. El primer sistema de liberación controlada responde a la presencia del neurotransmisor acetilcolina. En concreto, se utilizan nanopartículas de sílice mesoporosa funcionalizadas en su superficie con grupos de ácido fenilborónico y tapadas con la enzima acetilcolinesterasa mediante la formación de ésteres cíclicos de ácido fenilborónico entre las cadenas de oligosacáridos de la enzima y los grupos fenilborónicos de la superficie de las nanopartículas. En este caso la reacción enzimática produce ácido acético que da lugar a la hidrolisis de los ésteres borónicos, destapando los poros y liberando la carga contenida en el interior. Además, se evalúa la capacidad del dispositivo diseñado para liberar el citotóxico doxorubicina en células cancerosas en presencia de acetiltiocolina. El segundo sistema consiste en un nanodispositivo para la liberación controlada en respuesta al neurotransmisor L-glutamato. Para esto se utilizan nanopartículas tipo Janus de oro-sílice mesoporosa funcionalizadas con la enzima L-glutamato oxidasa en la parte del oro y con una puerta molecular autoinmolante de arilboronato en la superficie de la sílice. La liberación controlada se basa en el reconocimiento del L-glutamato por la enzima L-glutamato oxidasa y la posterior formación de peróxido de hidrogeno, que es la especie que induce la escisión de la puerta autoinmolante y la subsecuente apertura de los poros. Finalment es mostra que el sistema dissenyat és capaç d'alliberar un fàrmac citotòxic en cèl·lules de càncer de cervell després de detectar la presència de L-glutamat. / [CA] La present tesi doctoral titulada "Reconeixement de neurotransmissors basat en nanopartícules d'or i de sílice mesoporosa per a aplicacions de detecció i alliberació controlada" és una tesi realitzada per compendi d'articles la qual se centra en el disseny, preparació, caracterització i avaluació de diferents nanodispositius per a la detecció colorimètrica de neurotransmissors i sistemes d'alliberació controlada que responen a neurotransmissors basats en nanopartícules d'or i nanopartícules de sílice mesoporosa equipades amb lligands orgànics, efectors enzimàtics, portes moleculars i espècies cromofluorogénicos o medicaments. En el primer capítol s'introdueix una visió general del que són els neurotransmissors, les seves principals característiques i l'important paper que aquests tenen en el funcionament del nostre organisme. A més es presenta una descripció general de les propietats i potencials aplicacions de les nanopartícules d'or funcionalitzades amb lligands orgànics com a sistemes de detecció, i de les nanopartícules mesoporoses de sílice funcionalitzades amb portes moleculars com a sistemes d'alliberament controlat. A continuació, en el segon capítol es presenten els objectius generals que són abordats en els següents capítols experimentals. En el tercer capítol, es presenten tres sistemes de detecció colorimètrica de neurotransmissors basats en l'agregació de nanopartícules d'or doblement funcionalitzades amb lligands orgànics. El primer sistema és un sensor capaç de detectar de forma selectiva el neurotransmissor serotonina, utilitzant nanopartícules d'or funcionalitzades amb ditiobis (propionat de succinimidilo) i N acetil-L-cisteïna. El segon sistema consisteix en un sensor per a la detecció selectiva de neurotransmissor norepinefrina dissenyat a partir de nanopartícules d'or funcionalitzades amb 4- (liponiloxi) benzaldehid i Àcid 4-mercatofenilborònic. El tercer sistema està compost per nanopartícules d'or funcionalitzades amb 4- (liponiloxi) benzaldehid i N acetil-L-cisteïna, per a la detecció de normatanefrina un important biomarcador del tumor feocromocitoma. Tots aquests sistemes s'avaluen en mitjans competitius com sèrum sanguini u orina. En el quart capítol es mostren dos sistemes d'alliberament controlats enzimàticament basats en l'obertura de portes moleculars. El primer sistema d'alliberament controlat respon a la presència del neurotransmissor acetilcolina. En concret, s'utilitzen nanopartícules de sílice mesoporosa funcionalitzades en la seva superfície amb grups d'àcid fenilborònic i tapades amb l'enzim acetilcolina esterasa mitjançant la formació d'èsters cíclics d'àcid fenilborònic entre les cadenes d'oligosacàrids de l'enzim i els grups fenilborónicos de la superfície de les nanopartícules. En aquest cas, la reacció enzimàtica produeix àcid acètic que dóna lloc a la hidròlisi dels èsters borònics, destapant els porus i alliberant la càrrega continguda a l'interior. A més, s'avalua la capacitat del dispositiu dissenyat per alliberar el citotòxic doxorubicina en cèl·lules canceroses en presència d'acetiltiocolina. El segon sistema consisteix en un nanodispositiu per alliberació controlada en resposta al neurotransmissor L-glutamat, per al que s'utilitzen nanopartícules tipus Janus d'or-sílice mesoporosa funcionalitzades amb l'enzim L-glutamat oxidasa en la part de l'or i amb una porta molecular autoimmolant d'arilboronat a la superfície de la sílice. La alliberació controlada es basa en el reconeixement de L-glutamat per l'enzim L-glutamat oxidasa i la posterior formació de peròxid d'hidrogen, que és l'espècie que indueix l'escissió de la porta autoimmolant i la subseqüent obertura dels porus. Finalment es mostra que el sistema dissenyat és capaç d'alliberar un fàrmac citotòxic en cèl·lules de càncer de cervell després de detectar la presència de L-glutamat. / [EN] This doctoral thesis entitled "Neurotransmitters recognition based on gold and mesoporous silica nanoparticles for sensing and controlled release applications" it is a thesis carried out by compendium of articles, which is focused on the design, preparation, characterization and evaluation of nanodevices for the colorimetric sensing of neurotransmitters and controlled delivery systems responsive to neurotransmitters, based on gold nanoparticles and mesoporous silica nanoparticles equipped with organic ligands, enzymatic effectors, molecular gates and chromo-fluorogenic species or drugs. The first chapter introduces an overview about what neurotransmitters are, their main characteristics and the important role they play in the functioning of our body. In addition, a general description of the properties and potential applications of gold nanoparticles functionalized with organic ligands as detection systems and mesoporous silica nanoparticles functionalized with molecular gates as controlled delivery systems is presented. In the second chapter, the general objectives that are addressed in the following experimental chapters are presented. In the third chapter, three colorimetric detection systems of neurotransmitters based on the aggregation of gold nanoparticles doubly functionalized with organic ligands are presented. The first system is a sensor capable of selectively detecting the neurotransmitter serotonin, using gold nanoparticles functionalized with dithio-bis(succinimidyl propionate) and N acetyl-L-cysteine. The second system consists of a sensor for the selective detection of the neurotransmitter norepinephrine designed from gold nanoparticles functionalized with 4- (liponyloxy)benzaldehyde and 4-mercaptophenylboronic acid. The third system is composed of gold nanoparticles functionalized with 4-(liponyloxy)benzaldehyde and N-Acetyl-L-Cysteine, for the detection of normetanephrine, an important biomarker of the pheochromocytoma tumor. All these systems are evaluated in competitive media such as blood serum or urine. In the fourth chapter, two enzymatic controlled delivery systems based on the opening of molecular gates are developed. The first controlled delivery system responds to the presence of the neurotransmitter acetylcholine. Specifically, it consists of mesoporous silica nanoparticles functionalized on their surface with phenylboronic acid groups and capped with the enzyme acetylcholinesterase, via the formation of cyclic phenylboronic acid esters between the oligosaccharide chains of the enzyme and the phenylboronic groups on the nanoparticles surface. In this case, the enzymatic reaction produces acetic acid that induces the hydrolysis of the boronic esters, uncapping the pores and releasing the entrapped payload. In addition, the ability of the nanodevice to release the cytotoxic doxorubicin in cancer cells in the presence of acetylthiocholine is evaluated. The second delivery system consists of a nanodevice responsive to the neurotransmitter L-glutamate. It is based on Janus gold-silica mesoporous nanoparticles functionalized with the enzyme L-glutamate oxidase in the gold part and with a self-immolative arylboronate molecular gate on the surface of the silica. Controlled delivery is based on the recognition of L-glutamate by the enzyme L-glutamate oxidase and the subsequent formation of hydrogen peroxide, which results in the cleavage of the self-immolative gate and the uncapping of the pores. Finally, it is shown that the designed system is capable of releasing a cytotoxic drug in brain cancer cells after detecting the presence of L-glutamate. / The authors acknowledge financial support from the Spanish Government (Projects MAT2015-64139-C4-1-R, MAT2015-64139-C4-4-R (MINECO/FEDER) and Project AGL2015-70235-C2-2-R) and the Generalitat Valenciana (Projects PROMETEOII/2014/047 and PROMETEO/2018/024). T. Godoy-Reyes is grateful to Generalitat Valenciana for her Santiago Grisolía fellowship. A. García-Fernández is grateful to the Spanish Government for her FPU fellowship. A. Llopis-Lorente thanks “La Caixa” Foundation for his PhD grant. SCSIE (Universitat de València) is gratefully acknowledged for all the equipment employed. / Godoy Reyes, TM. (2020). Neurotransmitters recognition based on gold nanoparticles and mesoporous silica nanoparticles for sensing and controlled release applications [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/158420 / TESIS