Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão e outros canídeos como hospedeiros definitivos e os bovinos como principais hospedeiros intermediários. Causa nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, gerando prejuízos significativos na pecuária mundial. Como Toxoplasma gondii e Plasmodium, N. caninum possui um sistema específico de secreção que permite a invasão ativa do parasita na célula hospedeira, formação do vacúolo parasitóforo e replicação. Devido ao seu ciclo intracelular, várias estratégias foram desenvolvidas para caracterizar o processo de invasão no filo, como deleção ou controle da expressão de genes envolvidos. Entre os genes com papel importante no processo invasivo, NcMic2-like1 possui destaque já que o soro contra essa proteína recombinante inibiu 60% da invasão de N. caninum in-vitro. Essa proteína micronêmica possui domínios adesivos (uma integrina e seis trombospondinas) que atuam na ligação entre os receptores da célula hospedeira e o motor de actina e miosina do parasita, possibilitando a invasão ativa. O objetivo central do trabalho foi o desenvolvimento de ferramentas genéticas para a deleção e hiperexpressão de NcMic2-like1 e outras proteínas em N. caninum para a compreensão profunda desse mecanismo, além da caracterização, localização e expressão de NcMic2-like1. Para isso dois modelos baseados na resistência a drogas e integração ao genoma do parasita foram construídos. Um se baseia na resistência contra cloranfenicol (pelo gene Cloranfenicol Acetil Transferase - CAT) e o outro contra pirimetamina (pela mutação da Diidrofolato Redutase-Timidilato Sintase - DHFRM2M3). As sequências que conferem resistência foram ligadas ao promotor e região 3\' UTR de três genes de N. caninum, NcSAG1 (ou SAG1-like); NcDHFR ou NcHXGPRT conferindo resistência às drogas após transfecção. A esses vetores de resistência foram ligadas duas sequências do controle de expressão por tetraciclina, o sistema TetR/tetO. Adaptando o sistema de T. gondii para N. caninum, TetR foi expresso sob controle do promotor RPS13 ou Tubulina de N. caninum e tetO controlou a expressão de Lac-Z (?-galactosidase), ii uma enzima repórter. TetR e tetO foram transfectados de modo estável utilizando os vetores CAT e DHFRM2M3. O sistema foi responsivo à adição de tetraciclina, além de indicar um meio provavelmente independente de TetR quando apenas tetO foi avaliado em N. caninum. Foi possível expressar Lac-Z em N. caninum, possibilitando o desenvolvimento e padronização de ensaios de invasão, crescimento e detecção do taquizoíta. Também foi realizada a detecção de YFP (proteína amarelo fluorescente) nos taquizoítas transfectados com YFP fundida em TetR. Essas ferramentas de inserção e deleção de genes possibilitaram a construção de vetores para a hiper expressão ou deleção de NcMic2-like1. Para hiper expressão o vetor foi obtido pela substituição de Lac-Z pelo gene NcMic2-like1. Para deleção de NcMic2-like1 o vetor foi desenvolvido pela ligação do seu promotor e região 3\' UTR ä CAT ou NcDHFRM2M3, que promove a substituição do gene alvo pelos de resistência por recombinação homóloga. Adicionalmente foram desenvolvidas formas para a expressão e purificação de proteínas em N. caninum. Também foi obtida a solubilização de NcMIC2-like1 recombinante pelo sistema pET28 após a adição de uma cauda solúvel amplificada do genoma de N. caninum. O desenvolvimento de métodos de manipulação genética é um fato inédito para N. caninum e possibilitará estudos moleculares mais profundos sobre os mecanismos de invasão e replicação, onde NcMic2-like1 aparece como primeira candidata para esses ensaios. / The Apicomplexa protozoan Neospora caninum is an obligate and intracellular parasite that has the dog and other canides as definitive host and especially cattle as intermediate hosts. It causes respectively encephalopathy. abortions and loss of fertility causing deep economic impact at the world livestock. As Plasmodium and Toxoplasma gondii, N. caninum has a specific system of active secretion, which allows the invasion of the parasite into the host cell, the establishment of parasitophorous vacuole and replication. Due to the intracellular cycle of parasite, several strategies have been developed to characterize the invasion process of the phylum, such as deletion or control of expression of related genes. Among the genes with an important role in the invasive process, NcMic2-like1 stands out, once the serum against the recombinant form inhibited the in vitro invasion of N. caninum up to 69%. This microneme protein has adhesive domains (one integrin and six thrombospondins) acting between the host cell receptors and the actin/myosin motor of the parasite, allowing the active invasion. The main aim of this work was the development of genetic tools for deletion and overexpression of NcMic2-like1 and other proteins in N. caninum for a deep understanding of this mechanism, in addition to the characterization, localization and expression of NcMic2-like1. Therefore two models based on the drug resistance and integration into the genome of the parasite were constructed. One was based on the resistance against chloramphenicol (chloramphenicol acetyl transferase gene by - CAT) and the other against pyrimethamine (by mutation of dihydrofolate reductase-thymidylate synthase - DHFRM2M3). The sequences that confer these two drug resistance patterns have been ligated to the promoter and the 3\' UTR region of three genes from N. caninum, NcSAG1 (or SAG1-like); NcDHFR or NcHXGPRT, conferring resistance to the drugs after transfection. These vectors were ligated to two sequences that confer resistance controlled by tetracycline, the TetR / tetO system. The T. gondii system was adapted for N. caninum. TetR was expressed under the control of N. caninum tubulin promoter and tetO controlled the expression of Lac-Z (?-galactosidase), a reporter enzyme. TetR and tetO were stably inserted in N. caninum after transfection iv with the vectors based on CAT and DHFRM2M3.The system was responsive following tetracycline presence, in addition to a TetR independent mechanism in N. caninum . Moreover, it was possible to express Lac-Z in N. caninum enabling the development and standardization of invasion, growth and detection tachyzoite assays. It was also possible to detect through fluorescence microscopy the YFP (yellow fluorescent protein) in tachyzoites transfected with YFP fused to TetR.. The tools for gene insertion and deletion allowed the construction of vectors for hiperexpression or deletion of NcMic2-like1. For hiperexpression the vector was obtained by the replacement of the Lac-Z by the NcMic2-like1 gene. For the NcMic2-like1 deletion the vector was achieved after the ligation of its promoter and 3 \'UTR region to CAT or NcDHFRM2M3. This approach leads to the replacement of the target gene by the resistance gene through homologous recombination. Furthermore approaches for expression and purification of proteins in N. caninum were developed. Also, a soluble recombinant NcMIC2-like1 form was obtained with pET28 system added with a soluble tail amplified from a genome region of N. caninum. The development of genetic manipulation methods is an unprecedented event for N. caninum and will enable deeper molecular studies over mechanisms of invasion and replication, where NcMic2-like1 is the first candidate for these assays.

Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão e outros canídeos como hospedeiros definitivos e os bovinos como principais hospedeiros intermediários. Causa nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, gerando prejuízos significativos na pecuária mundial. Como Toxoplasma gondii e Plasmodium, N. caninum possui um sistema específico de secreção que permite a invasão ativa do parasita na célula hospedeira, formação do vacúolo parasitóforo e replicação. Devido ao seu ciclo intracelular, várias estratégias foram desenvolvidas para caracterizar o processo de invasão no filo, como deleção ou controle da expressão de genes envolvidos. Entre os genes com papel importante no processo invasivo, NcMic2-like1 possui destaque já que o soro contra essa proteína recombinante inibiu 60% da invasão de N. caninum in-vitro. Essa proteína micronêmica possui domínios adesivos (uma integrina e seis trombospondinas) que atuam na ligação entre os receptores da célula hospedeira e o motor de actina e miosina do parasita, possibilitando a invasão ativa. O objetivo central do trabalho foi o desenvolvimento de ferramentas genéticas para a deleção e hiperexpressão de NcMic2-like1 e outras proteínas em N. caninum para a compreensão profunda desse mecanismo, além da caracterização, localização e expressão de NcMic2-like1. Para isso dois modelos baseados na resistência a drogas e integração ao genoma do parasita foram construídos. Um se baseia na resistência contra cloranfenicol (pelo gene Cloranfenicol Acetil Transferase - CAT) e o outro contra pirimetamina (pela mutação da Diidrofolato Redutase-Timidilato Sintase - DHFRM2M3). As sequências que conferem resistência foram ligadas ao promotor e região 3\' UTR de três genes de N. caninum, NcSAG1 (ou SAG1-like); NcDHFR ou NcHXGPRT conferindo resistência às drogas após transfecção. A esses vetores de resistência foram ligadas duas sequências do controle de expressão por tetraciclina, o sistema TetR/tetO. Adaptando o sistema de T. gondii para N. caninum, TetR foi expresso sob controle do promotor RPS13 ou Tubulina de N. caninum e tetO controlou a expressão de Lac-Z (?-galactosidase), ii uma enzima repórter. TetR e tetO foram transfectados de modo estável utilizando os vetores CAT e DHFRM2M3. O sistema foi responsivo à adição de tetraciclina, além de indicar um meio provavelmente independente de TetR quando apenas tetO foi avaliado em N. caninum. Foi possível expressar Lac-Z em N. caninum, possibilitando o desenvolvimento e padronização de ensaios de invasão, crescimento e detecção do taquizoíta. Também foi realizada a detecção de YFP (proteína amarelo fluorescente) nos taquizoítas transfectados com YFP fundida em TetR. Essas ferramentas de inserção e deleção de genes possibilitaram a construção de vetores para a hiper expressão ou deleção de NcMic2-like1. Para hiper expressão o vetor foi obtido pela substituição de Lac-Z pelo gene NcMic2-like1. Para deleção de NcMic2-like1 o vetor foi desenvolvido pela ligação do seu promotor e região 3\' UTR ä CAT ou NcDHFRM2M3, que promove a substituição do gene alvo pelos de resistência por recombinação homóloga. Adicionalmente foram desenvolvidas formas para a expressão e purificação de proteínas em N. caninum. Também foi obtida a solubilização de NcMIC2-like1 recombinante pelo sistema pET28 após a adição de uma cauda solúvel amplificada do genoma de N. caninum. O desenvolvimento de métodos de manipulação genética é um fato inédito para N. caninum e possibilitará estudos moleculares mais profundos sobre os mecanismos de invasão e replicação, onde NcMic2-like1 aparece como primeira candidata para esses ensaios. / The Apicomplexa protozoan Neospora caninum is an obligate and intracellular parasite that has the dog and other canides as definitive host and especially cattle as intermediate hosts. It causes respectively encephalopathy. abortions and loss of fertility causing deep economic impact at the world livestock. As Plasmodium and Toxoplasma gondii, N. caninum has a specific system of active secretion, which allows the invasion of the parasite into the host cell, the establishment of parasitophorous vacuole and replication. Due to the intracellular cycle of parasite, several strategies have been developed to characterize the invasion process of the phylum, such as deletion or control of expression of related genes. Among the genes with an important role in the invasive process, NcMic2-like1 stands out, once the serum against the recombinant form inhibited the in vitro invasion of N. caninum up to 69%. This microneme protein has adhesive domains (one integrin and six thrombospondins) acting between the host cell receptors and the actin/myosin motor of the parasite, allowing the active invasion. The main aim of this work was the development of genetic tools for deletion and overexpression of NcMic2-like1 and other proteins in N. caninum for a deep understanding of this mechanism, in addition to the characterization, localization and expression of NcMic2-like1. Therefore two models based on the drug resistance and integration into the genome of the parasite were constructed. One was based on the resistance against chloramphenicol (chloramphenicol acetyl transferase gene by - CAT) and the other against pyrimethamine (by mutation of dihydrofolate reductase-thymidylate synthase - DHFRM2M3). The sequences that confer these two drug resistance patterns have been ligated to the promoter and the 3\' UTR region of three genes from N. caninum, NcSAG1 (or SAG1-like); NcDHFR or NcHXGPRT, conferring resistance to the drugs after transfection. These vectors were ligated to two sequences that confer resistance controlled by tetracycline, the TetR / tetO system. The T. gondii system was adapted for N. caninum. TetR was expressed under the control of N. caninum tubulin promoter and tetO controlled the expression of Lac-Z (?-galactosidase), a reporter enzyme. TetR and tetO were stably inserted in N. caninum after transfection iv with the vectors based on CAT and DHFRM2M3.The system was responsive following tetracycline presence, in addition to a TetR independent mechanism in N. caninum . Moreover, it was possible to express Lac-Z in N. caninum enabling the development and standardization of invasion, growth and detection tachyzoite assays. It was also possible to detect through fluorescence microscopy the YFP (yellow fluorescent protein) in tachyzoites transfected with YFP fused to TetR.. The tools for gene insertion and deletion allowed the construction of vectors for hiperexpression or deletion of NcMic2-like1. For hiperexpression the vector was obtained by the replacement of the Lac-Z by the NcMic2-like1 gene. For the NcMic2-like1 deletion the vector was achieved after the ligation of its promoter and 3 \'UTR region to CAT or NcDHFRM2M3. This approach leads to the replacement of the target gene by the resistance gene through homologous recombination. Furthermore approaches for expression and purification of proteins in N. caninum were developed. Also, a soluble recombinant NcMIC2-like1 form was obtained with pET28 system added with a soluble tail amplified from a genome region of N. caninum. The development of genetic manipulation methods is an unprecedented event for N. caninum and will enable deeper molecular studies over mechanisms of invasion and replication, where NcMic2-like1 is the first candidate for these assays.

O protozoário Neospora caninum é considerado um dos principais causadores de abortos infecciosos na pecuária de corte e de leite no mundo. No Brasil, a presença do parasita varia de acordo com a região do país e com o tipo de rebanho, com perdas maiores na agroindústria do leite que ultrapassam US$ 50 milhões ao ano. A neosporose possui como principal manifestação clínica as perdas fetais ou abortamentos em bovinos, além de comprometimento neuronal esporádico em cães. Apesar da sua importância, a neosporose não possui atualmente tratamento eficaz e as opções de controle envolvem basicamente medidas de prevenção. As vacinas ainda são uma alternativa de desenvolvimento exploradas, sobretudo aquelas que utilizam antígenos recombinantes. Uma dificuldade ao se produzir proteínas recombinantes em sistemas de expressão heterólogos é a formação de corpúsculos de inclusão que são agregados de proteínas insolúveis. Estes agregados devem ser submetidos a processos dispendiosos para tornarem-se ativos, resultando num baixo rendimento da proteína final. Diversos recursos são utilizados para obtenção de proteínas solúveis, desde o emprego de diferentes técnicas de purificação, solubilização até o uso de tags de afinidade. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu e patenteou o vetor pET28/NcMIC2-like1/1081 que possui uma tag rica em ácido glutâmico acoplada, conhecida como Nc1081. Esta tag foi capaz de estimular a solubilidade da proteína micronêmica tipo 2 de N. caninum (NcMIC2-like1) fazendo com que a proteína recombinante (rNcMIC2-like1/1081) fosse expressa na forma solúvel. O presente trabalho procurou dar continuidade ao estudo com a rNcMIC2-like1/1080 e com a tag através da clonagem e expressão de uma outra proteína relacionada à invasão do parasita conhecida como proteína associada à adenil ciclase (NcCAP). A sequência codificadora da proteína foi clonada no vetor contendo a tag Nc1081, a proteína recombinante (rNcCAP/1081) foi expressa com um peso de 38 kDa na forma solúvel em tampão não desnaturante Tris-Cl. No teste de ELISA, as proteínas rNcMIC2-like1 e a rNcCAP acopladas ou não a tag foram detectadas com intensidade semelhante pelos respectivos soros policlonais anti-rNcMIC2-like1 e anti-rNcCAP, demonstrando que a presença da tag não influenciou no reconhecimento das proteínas. As proteínas recombinantes solúveis rNcMIC2-like1/1081 e rNcCAP/1081 ainda foram testadas através de ensaios in vitro de invasão e adesão. No ensaio de invasão, a forma solúvel de NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) na concentração de 5 ?g/mL, aumentou a invasão das células VERO pelo parasita, enquanto sua forma insolúvel (rNcMIC2-like1) diminuiu a invasão. Já no teste de adesão (binding), foi possível identificar que a rNcMIC2-like1/1081 aderiu à proteína serina treonina fosfatase 2C, ao fator de alongamento alfa 1 e a proteína hipotética identificada ii como NCLIV_029860, enquanto a rNcCAP/1081 aderiu à proteína hipotética NCLIV_041330. O presente trabalho permitiu o início de estudos das propriedades funcionais das proteínas NcMIC2-like1 e NcCAP que seriam inviáveis com suas formas recombinantes insolúveis, demonstrando a aplicabilidade do vetor com a tag 1081. / Neospora caninum parasite is considered as a major cause of infectious abortion in beef and milk cattle in the world. In Brazil, the presence of the parasite varies in dairy or beef herd and according to the region with greater losses in dairy industry that exceed $ 50 million per year. Neosporosis has as main clinical manifestation fetal losses or abortion in cattle, in addition to sporadic neuronal impairment in dogs. Despite its importance, neosporosis has currently no effective treatment and control options rely primarily on preventive measures. Vaccines still represent an alternative explored by the veterinary industry, especially those employing recombinant antigens. The difficulties regarding production of recombinant proteins in heterologous expression systems are formation of inclusion bodies, which are insoluble protein aggregates. These aggregates have to undergo costly procedures to become active, resulting in low yield of final protein. Many techniques are used to obtain soluble proteins ranging from different purification or solubilizing techniques to the use of affinity tags. Our research group has developed and patented a vector pET28/NcMIC2-like1/1081 that has a rich glutamic acid tag attached, known as Nc1081. This tag is capable of stimulating the solubility of the recombinant micronemic protein type 2 like 1 of N. caninum (rNcMIC2-like1), expressingsoluble rNcMIC2-like1/1081. This study aimed to continue the study with rNcMIC2-like1/1080 and the tag by cloning and expressing another protein related to parasite invasion known as cyclase-associated protein (NcCAP). The protein coding sequence was cloned into the vector containing the Nc1081 tag, recombinant protein (rNcCAP/1081) was expressed with a molecular weight of 38 kDa in soluble form in non-denaturing Tris-Cl. In the ELISA test, rNcMIC2- like1 protein and rNcCAP coupled or not with the tag were detected with similar intensities by the respective polyclonal anti-sera rNcMIC2-like1 and antirNcCAP, demonstrating that the tag did not decrease the recognition of the proteins. Soluble recombinant proteins rNcMIC2-like1/1081 and rNcCAP/1081 were also tested in vitro in invasion and binding tests. In the invasion assay, a soluble form of NcMIC2-like1 (rNcMIC2-like1/1081) at a concentration of 5 ?g/mL increased the VERO cell invasion by the parasite, while its insoluble form (rNcMIC2-like1) decreased invasion. In the binding test, the rNcMIC2-like1/1081 bound to protein serine threonine phosphatase 2C, the elongation factor 1 alpha and the hypothetical protein identified as NCLIV_029860, while rNcCAP/1081 bound to the hypothetical protein NCLIV_041330. The current work allowed the initial functional studies of the NcMIC2-like1 and NcCAP proteins, otherwise unfeasible with their insoluble recombinant forms, demonstrating the applicability of the vector with the tag 1081.