Orientadores: Gonçalves Amarante Guimarães Pereira, Laudiene Evangelista Meyer / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:23:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toni_IsabellaMacedo_M.pdf: 5580969 bytes, checksum: 6316597533645e14651af065e8968c0a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Há no mundo um consenso sobre a necessidade de se encontrar fontes de carbono renováveis para a substituição do petróleo. O cultivo de microalgas tem sido considerado uma alternativa promissora para suprir essas cadeias carbônicas e biocombustíveis, visto que são microorganismos fotossintetizantes que podem acumular grandes quantidades de triacilglicerol (TAG) como reserva energética. A transesterificação desses TAG por alcoóis simples gera alquil-esteres, cujas propriedades são muito próximas às encontradas na composição do biodiesel. O glicerol, subproduto da produção de biodiesel, pode ser convertido em propeno, bloco de construção fundamental para a indústria petroquímica. A obtenção de TAG de microalgas requer o cultivo do microorganismo, a recuperação da biomassa do meio líquido e o processamento dessa biomassa para separação da fração lipídica. As etapas de recuperação da biomassa e obtenção da fração lipídica são estágios realmente críticos, de modo que são considerados os principais obstáculos para a viabilidade econômica da produção. A indução artificial da secreção das reservas lipídicas é uma idéia promissora que pode viabilizar a produção de lipídios por microalgas em escala industrial. Em vista disso, o objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de bases metodológicas para a construção de um vetor que proporcione comprometimento de das reservas lipídicas com o processo de exocitose. Alguns membros da família SNARE são responsáveis por comprometer vesículas com a via exocítica. Propriedade que pode ser artificialmente introduzida nas reservas lipídicas por meio do domínio SNARE. A busca no genoma de Neochloris oleoabundans, microalga com alto teor lipídico sequenciada por nosso laboratório, indicou 19 sequências pertencentes à família SNARE. A análise dessas sequencias indicou o gene responsável pela via exocítica. A principal forma de reserva energética de microalga são vesículas de TAG chamadas de oilbodies. Em plantas é encontrada a proteína oleosina inserida nesses oilbodies, a cuja existência relaciona-se a um aumento de óleo nas sementes. A oleosina pode ser um bom candidato para carregar o motivo SNARE para as reservas lipídicas dos oilbodies, levando-os a se fusionarem com a membrana plasmática. A necessidade de se confirmar a funcionalidade da oleosina em microalgas levou a construção de um plasmídeo contendo a ORF para oleosina fundida no mesmo quadro de leitura com uma marca visual. A construção foi adaptada para testes em Chlamydomonas reinhardtii, uma miroalga modelo. Uma marca de seleção por antibiótico foi adicionada a fim de se facilitar a busca por tranformantes. Uma vez confirmado o funcionamento da oleosina, uma construção contendo a proteína ligada ao domínio SNARE de exocitose pode ser construída para N. oleoabundans ou qualquer microalga com potencial industrial. Uma tecnologia como essa permitiria a recuperação dos lipídios diretamente do meio de cultura, eliminando etapas críticas para a produção de hidrocarbonetos em larga escala a partir de microalgas e tem potencial de aumentar a taxa de conversão da energia capturada da biomassa em óleo / Abstract: It is worldwide accepted the vital need to find renewable carbon sources to replace the use of petrol. Microalgae can storage triacylglycerol (TAG) as their major energy reservoir. Hence, culturing these photosynthetic microorganisms has been considered a promising alternative for renewable carbon sources and biofuels production. TAG transestherification produces alquil-esther, which properties are very similar to those found in biodiesel. Furthermore, a byproduct of biodiesel production is glicerol, which can be easily converted to propen, the fundamental block for petro-chemistry industry. Algal TAG production requires the cultivation of the microorganism, followed by dewatering and processing of its biomass in order to obtain the lipid fraction. These last two processes are considered critical and may be regarded as one of the primary obstacles to economic viability of production. Thus, engineered organisms that actively secrete their triacylglycerol content would afford the production of lipids by microalgae in an industrial scale. The aim of this study, therefore, is to establish methodological basis for the development of a molecular device which commits lipid reserves in the exocytosis pathway. Some proteins of SNARE family have the ability to engage their associated vesicles to exocytosis. This property can be artificially introduced into the lipid reserves through the SNARE domain. The triacylglycerol is stored in vesicles called oilbodies, which are the main energy storage in microalgae. Seed plants oilbodies contain imbibed in their membranes proteins called Oleosins, which existence was related to increase in oil reservoir. The anchoring ability of oleosins may be used to carry the SNARE motif to oilbodies, causing them to fuse with the plasma membrane. The genome of Neochloris oleoabundans, a high lipid content microalga, was sequenced by our laboratory. Genome wide analysis revealed 19 SNAREs sequences. The probable SNARE required in the exocytosis pathway and the domains were identified and characterized. Aiming to confirm the functionality of oleosin in microalgae, a plasmid containing an oleosin fused in frame with a GFP reporter was built for Chlamydomonas reinhardtii, a model microalga. An antibiotic resistance marker was added to allow efficient screening of transformed cells. Once the oloeosin function is confirmed in the model, a molecular device comprising the exocytic SNARE domain connected to an oleosin can be built. A device like this can be adapted not only for N. oleoabundans, but also to any microalgae with industrial use potential. Such technology could enable the recovery of TAG lipids directly from the culture medium and would eliminate costly stages of high-scale hydrocarbon production from microalgae. Moreover, it could potentially improve the conversion rate of energy to lipids / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Laudiene Evangelista Meyer / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T11:06:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Curado_RaissaEstrela_M.pdf: 3964462 bytes, checksum: 28b1b79bbee3ec07ebb8a2d3fecebcef (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A necessidade do desenvolvimento de alternativas energéticas renováveis, limpas e de baixo custo, capazes de substituir o "petrodiesel" sem impactar a produção de alimentos, é a principal motivação para o desenvolvimento do projeto. Entre as alternativas, o cultivo de microalgas tem sido recorrentemente relatado como muito promissor. Microalgas são espécies unicelulares fotossintetizantes capazes de acumular lipídeos naturalmente. Entretanto, ainda não há cepas desenvolvidas para o uso industrial, havendo diversas barreiras tecnológicas a serem vencidas, como os altos custos de implantação e a dificuldade de encontrar organismos que aliem velocidade de crescimento e boa produtividade lipídica. Para o desenvolvimento do projeto selecionamos a espécie de microalga Neochloris oleoabundans devido à sua capacidade naturalmente superior em acumular lipídeos. O principal objetivo foi identificar estímulos ambientais capazes de induzir maior produção e acúmulo de cadeias carbônicas lipídicas nessa espécie e, então, iniciar análises moleculares nessas situações. Os primeiros cultivos de N. oleoabundans caracterizaram-se pelo crescimento muito lento nos diversos meios autotróficos testados, porém, ao final do projeto, percebemos que os cultivos cresciam com velocidade muito superior às culturas iniciais. Ao compilar os dados de crescimento obtidos nesses dois anos, vimos que as taxas de duplicação de N. oleoabundans foram elevadas em cerca de seis vezes nesse período. Acreditamos que houve seleção artificial de células mais velozes à medida que repicávamos os cultivos a fim de iniciar culturas novas. Para identificar condições capazes de induzir maior acúmulo lipídico, N. oleoabundans foi submetida a situações de estresse como privação de fósforo e nitrogênio. Observamos que a privação de nitrogênio foi capaz de desencadear aumento de teor lipídico muito expressivo. Então, sequenciamos o genoma e averiguamos a expressão gênica de algumas enzimas da via de biossíntese de ácidos graxos em privação de nitrogênio. Observamos também que cultivos feitos em meio heterotrófico mostravam-se rapidamente contaminados. A montagem do genoma pode dar indícios da natureza dessa contaminação recorrente, pois foram encontradas sequências de uma bactéria do gênero Brevundimonas. Ao investigar esse contaminante vimos que o mesmo pode estar em simbiose com a microalga, há relatos na literatura sobre simbioses dessa natureza, onde o procarioto fornece vitamina B12 e a microalga, matéria orgânica para o crescimento do mesmo. Encontramos enzimas dependentes dessa vitamina como cofator no genoma de N. oleoabundans, indicando que pode haver uma simbiose entre esses organismos. Devido aos bons resultados obtidos acreditamos que o estudo e manipulação a nível molecular dessa espécie podem torná-la potencialmente aplicável na indústria. O entendimento do mecanismo molecular de acúmulo lipídico sobre estresse, aliado ao potencial de seleção artificial de cepas velozes revelado, permite gerar conhecimento suficiente para agrupar em uma única espécie rápido crescimento e teor lipídico elevado / Abstract: Coal, petroleum and natural gas are cheap and may not run out soon. However, considering political and environmental implications associated with them, there appears to be no net economic benefit in its use. Therefore, sustainable alternatives are really necessary due to the global growing demand of energy. Among the alternatives, cultivation of microalgae has been reported as a promising technology. Algae use sunlight to produce biochemical energy via photosynthesis and its oil productivity and growth rates greatly exceeds that of vascular plants. Unlike the existing crop-derived biofuels, algae fuels can be produced without encroaching on food cropland. The technology is being intensively investigated by nearly every major and startups oil companies nowadays. However, there are no species developed for industrial use and there are several technological barriers to overcome. In this study we investigated the microalga Neochloris oleoabundans, selected for its naturally higher ability to accumulate lipids. Initially, N. oleoabundans growth rates were very low. We decreased by six times the cell doubling time, we believe that occurred artificial selection of faster growing cells during the master's period. Nitrogen starvation led to great increases in cellular lipid content. Real-time PCR experiments show that some key enzymes of fatty acid biosynthesis are differentially expressed in nitrogen starved cultures. The genome of N. oleoabundans was sequenced using Solexa® technology and preliminary analysis show the presence of a bacterium associated with the microalga. We believe that there is a symbiotic relationship between them, since the alga needs vitamin B12 despite being not capable of producing it. Our analysis show that N. oleoabundans is a very promising strain. The excellent response to nitrogen starvation and knowledge acquired with genomic approach led us to a better understanding of N. oleoabundans metabolism, indicating that this specie may be suitable for industrial application / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T13:33:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Favarelli_BrunaRoncon_M.pdf: 2940134 bytes, checksum: c25c1c788926b1cc98e26794405efafa (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A busca de fontes sustentáveis de bicombustíveis tem levado ao interesse renovado em microalgas como potencial matéria-prima. Esses organismos acumulam grandes quantidades de óleos sob a forma de triacilglicerídeos (TAG) quando em privação de nutrientes, entretanto, uma análise aprofundada dos mecanismos moleculares envolvidos nesse acúmulo ainda está no início. É improvável que uma espécie apresente naturalmente todas as características necessárias para a produção industrial de bicombustíveis, como altas taxas de crescimento e acúmulo de lipídios. Sendo assim, faz-se necessária a ampliação do conhecimento da genética, bioquímica e das técnicas de manipulação desses organismos para que futuramente a cepa ideal seja obtida por engenharia genética. A microalga verde Neochloris oleoabundans foi escolhida como objeto de estudo por ser naturalmente capaz de acumular grandes quantidades de TAG quando em privação de nitrogênio. Seu genoma foi sequenciado, visando à obtenção de indícios da origem genética do fenótipo de interesse. Foram preditos 10.006 genes distribuídos ao longo de 1.544 scaffolds, totalizando aproximadamente 40 Mb de genoma nuclear. A análise comparativa com outras cinco espécies de microalgas mostrou que o conteúdo do genoma de Neochloris se assemelha ao de Chlorella variabilis. A presença de famílias gênicas ortólogas muito pequenas na espécie estudada motivou a expansão dessa análise para as demais espécies de alga já sequenciadas, indicando que essa ausência de expansões gênicas pode ser um padrão de microalgas. As famílias gênicas exclusivas de Neochloris mostraram que a parede celular dessa espécie pode ser formada por hemicelulose e quitina, já que foram encontrados genes da síntese desses polissacarídeos no genoma. As vias de metabolismo energético foram mapeadas, permitindo entender o caminho energético existente na célula estudada. Além disso, a comparação do número de cópias dos diversos genes envolvidos nos processos de interesse permitiu levantar vias e moléculas chaves para estudos mais detalhados. Uma enzima chave envolvida na sinalização de privação de nitrogênio, a AMP deaminase, foi encontrada em maior número de cópias e pode estar envolvida no direcionamento para acúmulo de TAG. Há indícios de que um possível resultado da ausência de nitrogênio seja a remodelação de membranas 9 celulares, principalmente do cloroplasto, e quebra de pigmentos fotossintéticos. Essas reações podem gerar ácidos graxos livres e substâncias tóxicas para as células que são neutralizadas através de sua participação na síntese de TAG. O mecanismo de concentração de carbono empregado por um organismo fotossintetizante afeta o acúmulo de biomassa, pois plantas que utilizam o mecanismo C4-like são mais eficientes na fixação de carbono do que plantas C3. Não foi possível determinar qual o mecanismo preferencialmente empregado por Neochloris, mas grande parte dos genes envolvidos no mecanismo C4-like foi identificada no genoma. Tais genes consistem em alvos para manipulação genética, visando direcionar a fixação de carbono para C4-like. A maior eficiência fotossintética resultante pode ocasionar aumento da biomassa e do acúmulo de cadeias carbônicas na célula dessa alga, podendo gerar um maior acúmulo lipídico / Abstract: The search for sustainable sources for the production of biofuels has resulted in an increased interest in microalgae as a potential feedstock. These microorganisms accumulate large amounts of lipids in the form of triglycerides (TAG) when subjected to some types of nutrient deprivation. However, the elucidation of the molecular mechanisms involved in these metabolic responses is far from necessary for the effective use of microalgae in industrial processes. It is unlikely that a species naturally present all the characteristics necessary for the industrial production of biofuels, as for example high rates of growth and lipid accumulation. Thus, it is necessary to expand the knowledge of genetics, biochemistry and genetic manipulation of microalgae in order to adapt the productivity of wild-strains to the demands of the bioenergy sector. In this context, the green algae Neochloris oleoabundans was chosen as the object of study because it is naturally capable of accumulating large amounts of TAG when subjected to nitrogen deprivation. Its genome was sequenced in order to obtain genetic data to increase the understanding and, in the future, to produce phenotypes of interest. A total of 10,006 predicted genes were identified over the 1,544 scaffolds generated, totalizing approximately 40 Mb of nuclear genome. The comparative analysis with five other microalgae species showed that the genetic content of Neochloris resembles that of other green algae, Chlorella variabilis. The presence of small gene families in the species studied led to the expansion of this analysis for some other sequenced species of algae, indicating that the absence of gene expansions can be a common pattern of microalgae. The unique Neochloris gene families showed that the cell wall of this species may be formed from hemicelluloses and chitin, since genes associated to the metabolism of these polysaccharides were found in the in the genome. Metabolic reconstruction of energetic pathways allowed an increase in the comprehension of energy routes in Neochloris. Moreover, comparing the number of copies of several genes involved in the processes of interest allowed us the identification of key candidates for further studies. A key enzyme involved in signaling nitrogen deprivation, AMP deaminase, was found as presenting 11 various gene copies in Neochloris genome and may be involved in the response of TAG accumulation in situations of nitrogen deprivation. Also, there are some results indicating that the lack of nitrogen may promote the remodeling of cell membranes, especially in the chloroplast, as well as the breakage of photosynthetic pigments. These responses would generate free fatty acids and toxic substances, which would be therefore neutralized by the synthesis of TAG. Other response studied was the carbon concentration after photosynthesis. The carbon concentration mechanism employed by a photosynthetic organism affect the accumulation of biomass; it is known that plants using C4-like mechanism are more efficient than C3 plants. Despite the in silico data is insufficient to determine the mechanism employed by Neochloris, it was observed that most of the genes involved in C4-like mechanism were identified in its genome. These genes are interesting targets for genetic manipulation of Neochloris in order to adjust its metabolism towards a C4-like metabolism. In that case, it is expected that the resulting higher photosynthetic efficiency can lead to an increased biomass and larger accumulation of carbon chains in the cell of this alga, resulting in an increase in lipid productivity rates / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Microalgae are promising candidates for biofuel production, CO2 biomitigation, and production of a variety of value-added products. However, high production costs and large energy consumption have been a major concern hindering the commercialization of microalgal products and processes. In addition, biological contamination and oxygen stress are two of the major contributors to these challenges. The objective of this project was twofold: 1) developing a novel strategy for control of biological contamination to enable non-sterile cultivation of microalgae such as N. oleoabundans, and 2) developing advanced deoxygenation mechanisms to reduce oxygen accumulation in the culture. It was found that addition of appropriate amount of NaHCO3 could effectively inhibit the growth of protozoa while its inhibition on microalgae was much less and could be alleviated by increasing pH to an appropriate level. It was also found that adding 160 mM NaHCO3 in media or decreasing incident light intensity to 100 W/m2 would help alleviate the oxidative stress to cells at 400% of air saturation. The feasibility of contamination-free non-sterile cultivation of freshwater green alga N. oleoabundans was verified using long-term continuous cultivation in a 15-liter TPBR with non-sterile medium and aeration. Furthermore, localized oxygen removal using hydrophobic hollow membranes was found to effectively reduce dO2 and increase lipid accumulation. These results have the potential to be translated into low-cost cultivation of freshwater microalgae processes for production of value-added microalgal products. At a more fundamental level, the mechanisms of the inhibition of NaHCO3 on microalgae and protozoa were discussed. Efforts were also made to simulate the effects of incident light intensity on light distribution, cell growth kinetics, and lipid accumulation of N. oleoabundans under non- sterile cultivation conditions.

In this paper, replacing complete or partly of growth mediums with secondarily wastewater was studied. Lipid content of Neochloris oleoabundans grown in a 0.3 X SE medium and autoclaved secondarily treated wastewater mixture was 22.27 % (w/w). The maximum biomass concentration of N. oleoabundans grown in wastewater with no additional nutrients was 0.636 g/L with 33% (w/w) glucose. Two culture lines, MA, and NA were isolated within our laboratory and could grow in secondarily treated wastewater with no additional nutrients. The maximum biomass concentration of MA in batch culture was 0.860 g/L and the sum of glucose and xylose was 40% (w/w). The maximum biomass concentration of NA was 1.562 g/l and the sum of glucose and xylose was 33.8% (w/w). The maximum specific growth rates of NA and MA were determined to be 0.0566 and 0.0337 per hour.