O estudo das interações planta-microrganismos tem sido de grande interesse ao longo dos últimos anos. Atualmente, as interações que ocorrem entre microrganismos que vivem em estreita relação também vêm merecendo grande atenção, pois forças competitivas e mutualísticas podem induzir a produção de novos metabólitos bioativos. Portanto, estudar interações existentes entre os microrganismos endofíticos que colonizam uma mesma planta parece ser uma estratégia promissora para a obtenção de substâncias quimicamente diferentes, eventualmente bioativas. Através da utilização de culturas mistas de microrganismos, o presente trabalho contribuiu para o conhecimento da relação existente entre os fungos endofíticos SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) e SS84 (Phoma betae), isolados da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (yacon), e sua implicação no aumento da diversidade química de produtos naturais microbianos, com o intuito de se identificar metabólitos secundários anticancerígenos. Para isso, os fungos foram cultivados em culturas singles e mistas em meios de cultivo líquidos e semi-sólidos. Foram utilizados diferentes meios de cultura, diferentes maneiras de se estabelecer o cultivo misto e diferentes formas de extração. Os extratos foram analisados química e biologicamente. Após fracionamento, foram isoladas cinco substâncias: afidicolina (I), 3-desóxi-afidicolina (II), estenfiperilenol (III), alterperilenol (IV) e alternariol monometil éter (V), sendo as duas primeiras de origem terpênica e as outras de origem policetídica. As substâncias I e II foram produzidas pelo fungo SS67, sendo que a produção de I aparentemente aumentou nas culturas mistas líquidas com SS13 e SS84, diminuindo consideravelmente na cultura mista com SS77. Devido à afidicolina ser um composto altamente citotóxico, os cultivos do fungo SS67 originaram extratos muito ativos frente aos ensaios de citotoxicidade em células cancerígenas. A substância III, primeiramente, só foi detectada por CLAE-DAD na cultura mista dos fungos SS67 e SS77, e a produção da substância IV foi maior nessa cultura mista que na cultura simples do fungo SS77 (meio fermentativo de extrato de malte). Provavelmente esses compostos foram produzidos por SS77 em resposta à presença de SS67. O extrato obtido durante esse cultivo misto foi o que apresentou maior atividade citotóxica frente à linhagem celular MDAMB-435 (câncer de mama). Posteriormente, a substância III foi também isolada da cultura simples do fungo SS77 cultivado em outras condições (meio fermentativo PDB), juntamente com a substância V. Os experimentos de antagonismo em placa de Petri envolvendo esses dois fungos revelaram, ainda, a presença de vários outros compostos na zona de inibição, que não correspondem às substâncias previamente isoladas de meio líquido, e podem ser responsáveis pelo efeito antagônico observado em meio semi-sólido. Os experimentos de atividade antagônica dos metabólitos produzidos pelos fungos evidenciaram que muitos compostos ativos, provavelmente, são produzidos em quantidades ínfimas, o que impossibilita a detecção por CLAE-DAD. Além disso, verificou-se que a substância I não possui atividade antifúngica significativa contra os fungos SS13, SS50 e SS77 e que a inibição de SS67 por SS77 ocorre devido à produção de compostos difusíveis em meio semi-sólido, e ainda, muito provavelmente, pela produção da substância III e IV em meio líquido, além de outros policetídeos. A produção de metabólitos secundários por fungos endofíticos deve ocorrer em consequência do papel ecológico que desempenham na natureza. Assim, a utilização de culturas mistas desses microrganismos deve induzir a produção de compostos que não seriam produzidos em condições não naturais. / The study of plant-microbe interactions has been of great interest over the past years. Currently, the interactions that occur among organisms that live in close relationship also have been receiving great attention because mutualistic and competitive forces may induce the production of new bioactive metabolites. Therefore, studying the interactions between endophytic microorganisms that colonize the same plant seems to be a promising strategy for obtaining chemically different substances that might also be bioactive. Through the utilization of mixed microbial cultures, this study contributed to knowledge of the relationship among the endophytic fungi SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) and SS84 (Phoma betae), isolated from the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (yacon), and its role in the increase of the chemical diversity of microbial natural products, in order to identify anticancer secondary metabolites. For this aim, the fungi were grown in single and mixed cultures, both in liquid and semi-solid media. Different media, different approaches to establish the mixed cultures and different extraction methods were used. The extracts were analyzed chemically and biologically. After the fractionation, five compounds were isolated: aphidicolin (I), 3-deoxy-aphidicolin (II), stemphyperylenol (III), alterperylenol (IV) and alternariol monomethyl ether (V). Compounds I and II are terpene derivatives, while III, IV and V are polyketide derivatives. The substances I and II were produced by the fungus SS67, and the production of I apparently increased in liquid mixed cultures with SS13 and SS84, decreasing considerably in mixed culture with SS77. Due to the high cytotoxic activity of aphidicolin (I), the cultures of the fungus SS67 originated extracts highly active in the cytotoxicity assays in cancer cells. Substance III was only detected by HPLC-DAD in the mixed culture between the fungi SS67 and SS77, and the production of compound IV was higher in this mixed culture when compared to the single culture of the fungus SS77 (malt extract medium). Probably these compounds were produced by SS77 in response to the presence of SS67. The extract obtained during this mixed culture showed the highest cytotoxic activity against the cell line MDAMB-435 (breast cancer). In a subsequent fermentation in PDB medium, compound III was also isolated from the single culture of the fungus SS77 grown, along with compound V. Additionally, antagonism experiments in Petri dishes with these two fungi revealed the presence of several other compounds in the inhibition zone, which does not correspond to the substances previously isolated from the liquid medium, and may be responsible for the antagonistic effect observed in semi-solid medium. The experiments of antagonistic activity of metabolites produced by fungi showed that many active compounds are probably produced in very small quantities, making it impossible to detect by HPLC-DAD. Moreover, it was found that aphidicolin (I) did not have significant antifungal activity against the fungi SS13, SS50 and SS77 and that the SS67 inhibition by SS77 is due to the production of diffusible compounds in semi-solid medium, and likely, due to the production of compound III and IV in liquid medium, and other polyketides. The production of secondary metabolites by endophytic fungi probably occurs as a result of the ecological role they play in nature. Thus, the use of mixed cultures of these microorganisms may induce the production of compounds that would not be produced under unnatural conditions.

O estudo das interações planta-microrganismos tem sido de grande interesse ao longo dos últimos anos. Atualmente, as interações que ocorrem entre microrganismos que vivem em estreita relação também vêm merecendo grande atenção, pois forças competitivas e mutualísticas podem induzir a produção de novos metabólitos bioativos. Portanto, estudar interações existentes entre os microrganismos endofíticos que colonizam uma mesma planta parece ser uma estratégia promissora para a obtenção de substâncias quimicamente diferentes, eventualmente bioativas. Através da utilização de culturas mistas de microrganismos, o presente trabalho contribuiu para o conhecimento da relação existente entre os fungos endofíticos SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) e SS84 (Phoma betae), isolados da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (yacon), e sua implicação no aumento da diversidade química de produtos naturais microbianos, com o intuito de se identificar metabólitos secundários anticancerígenos. Para isso, os fungos foram cultivados em culturas singles e mistas em meios de cultivo líquidos e semi-sólidos. Foram utilizados diferentes meios de cultura, diferentes maneiras de se estabelecer o cultivo misto e diferentes formas de extração. Os extratos foram analisados química e biologicamente. Após fracionamento, foram isoladas cinco substâncias: afidicolina (I), 3-desóxi-afidicolina (II), estenfiperilenol (III), alterperilenol (IV) e alternariol monometil éter (V), sendo as duas primeiras de origem terpênica e as outras de origem policetídica. As substâncias I e II foram produzidas pelo fungo SS67, sendo que a produção de I aparentemente aumentou nas culturas mistas líquidas com SS13 e SS84, diminuindo consideravelmente na cultura mista com SS77. Devido à afidicolina ser um composto altamente citotóxico, os cultivos do fungo SS67 originaram extratos muito ativos frente aos ensaios de citotoxicidade em células cancerígenas. A substância III, primeiramente, só foi detectada por CLAE-DAD na cultura mista dos fungos SS67 e SS77, e a produção da substância IV foi maior nessa cultura mista que na cultura simples do fungo SS77 (meio fermentativo de extrato de malte). Provavelmente esses compostos foram produzidos por SS77 em resposta à presença de SS67. O extrato obtido durante esse cultivo misto foi o que apresentou maior atividade citotóxica frente à linhagem celular MDAMB-435 (câncer de mama). Posteriormente, a substância III foi também isolada da cultura simples do fungo SS77 cultivado em outras condições (meio fermentativo PDB), juntamente com a substância V. Os experimentos de antagonismo em placa de Petri envolvendo esses dois fungos revelaram, ainda, a presença de vários outros compostos na zona de inibição, que não correspondem às substâncias previamente isoladas de meio líquido, e podem ser responsáveis pelo efeito antagônico observado em meio semi-sólido. Os experimentos de atividade antagônica dos metabólitos produzidos pelos fungos evidenciaram que muitos compostos ativos, provavelmente, são produzidos em quantidades ínfimas, o que impossibilita a detecção por CLAE-DAD. Além disso, verificou-se que a substância I não possui atividade antifúngica significativa contra os fungos SS13, SS50 e SS77 e que a inibição de SS67 por SS77 ocorre devido à produção de compostos difusíveis em meio semi-sólido, e ainda, muito provavelmente, pela produção da substância III e IV em meio líquido, além de outros policetídeos. A produção de metabólitos secundários por fungos endofíticos deve ocorrer em consequência do papel ecológico que desempenham na natureza. Assim, a utilização de culturas mistas desses microrganismos deve induzir a produção de compostos que não seriam produzidos em condições não naturais. / The study of plant-microbe interactions has been of great interest over the past years. Currently, the interactions that occur among organisms that live in close relationship also have been receiving great attention because mutualistic and competitive forces may induce the production of new bioactive metabolites. Therefore, studying the interactions between endophytic microorganisms that colonize the same plant seems to be a promising strategy for obtaining chemically different substances that might also be bioactive. Through the utilization of mixed microbial cultures, this study contributed to knowledge of the relationship among the endophytic fungi SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) and SS84 (Phoma betae), isolated from the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (yacon), and its role in the increase of the chemical diversity of microbial natural products, in order to identify anticancer secondary metabolites. For this aim, the fungi were grown in single and mixed cultures, both in liquid and semi-solid media. Different media, different approaches to establish the mixed cultures and different extraction methods were used. The extracts were analyzed chemically and biologically. After the fractionation, five compounds were isolated: aphidicolin (I), 3-deoxy-aphidicolin (II), stemphyperylenol (III), alterperylenol (IV) and alternariol monomethyl ether (V). Compounds I and II are terpene derivatives, while III, IV and V are polyketide derivatives. The substances I and II were produced by the fungus SS67, and the production of I apparently increased in liquid mixed cultures with SS13 and SS84, decreasing considerably in mixed culture with SS77. Due to the high cytotoxic activity of aphidicolin (I), the cultures of the fungus SS67 originated extracts highly active in the cytotoxicity assays in cancer cells. Substance III was only detected by HPLC-DAD in the mixed culture between the fungi SS67 and SS77, and the production of compound IV was higher in this mixed culture when compared to the single culture of the fungus SS77 (malt extract medium). Probably these compounds were produced by SS77 in response to the presence of SS67. The extract obtained during this mixed culture showed the highest cytotoxic activity against the cell line MDAMB-435 (breast cancer). In a subsequent fermentation in PDB medium, compound III was also isolated from the single culture of the fungus SS77 grown, along with compound V. Additionally, antagonism experiments in Petri dishes with these two fungi revealed the presence of several other compounds in the inhibition zone, which does not correspond to the substances previously isolated from the liquid medium, and may be responsible for the antagonistic effect observed in semi-solid medium. The experiments of antagonistic activity of metabolites produced by fungi showed that many active compounds are probably produced in very small quantities, making it impossible to detect by HPLC-DAD. Moreover, it was found that aphidicolin (I) did not have significant antifungal activity against the fungi SS13, SS50 and SS77 and that the SS67 inhibition by SS77 is due to the production of diffusible compounds in semi-solid medium, and likely, due to the production of compound III and IV in liquid medium, and other polyketides. The production of secondary metabolites by endophytic fungi probably occurs as a result of the ecological role they play in nature. Thus, the use of mixed cultures of these microorganisms may induce the production of compounds that would not be produced under unnatural conditions.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-15T12:08:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Santos, Irailton Prazeres - 579.5 CDD.pdf: 2652551 bytes, checksum: 3622e108d9dab2f7f5dafd30a0b8eb5b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-15T12:08:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Santos, Irailton Prazeres - 579.5 CDD.pdf: 2652551 bytes, checksum: 3622e108d9dab2f7f5dafd30a0b8eb5b (MD5) Previous issue date: 2015-02-11 / FACEPE, CAPES, CNPq / Fungos endofíticos vêm despertando grande interesse biotecnológico em virtude da aplicabilidade de seus metabólitos secundários na medicina, indústria e agricultura. A espécie Indigofera suffruticosa é uma planta encontrada no Brasil, conhecida por apresentar várias atividades biológicas. Nesse trabalho fungos endofíticos foram isolados de folhas de I. suffruticosa na Mata Atlântica e na Caatinga, do estado de Pernambuco, durante as estações seca e chuvosa, taxonomicamente caracterizados e avaliados quanto a produção de metabólitos com atividade antimicrobiana. Todos os fungos isolados foram submetidos a um screening preliminar, e os que apresentaram melhores resultados foram fermentados em diferentes meios de cultura líquidos e semi-sólidos, e tiveram sua atividade antimicrobiana análisada através do método de difusão em disco. O extrato metanólico de Nigrospora sphaerica (NsME) obtido a partir do clutivo em meio de cultura de arroz, e o extrato de acetato de etila de N. sphaerica (NsEAE) obtido a partir do sobrenadante após o cultivo no meio líquido Batata Dextrose, tiveram suas concentração mínima inibitória (CMI) e concentração mínima bactericida (CMB) determinadas contra bactérias Gram-negativas e bactérias Gram-positivas. O extrato NsEAE foi submetido a colunas cromatográficas e as frações e subfrações obtidas foram analizadas através de ressonância magnética nuclear, resultando na identificação do ácido indólico-3-carboxílico, o qual foi avaliado quanto a sua atividade anti-Candida. Um total de 107 fungos foram isolados e identificados de acordo com as características morfológicas e chaves taxonómicas. Entre os nove táxons identificados, Colletotrichum gloeosporioides (13,4%), Pseudocochliobolus pallescens (8,3%), Nigrospora sphaerica [Khuskia oryzae] (7,4%), e Pestalotiopsis maculans (6,9%) foram os mais frequentes. Curvularia australiensis e Chaetomella raphigera foram isolados apenas na Caatinga durante períodos seco e chuvoso, respectivamente e são relatadas como a primeira vez que foram isoladas a partir de uma planta na Caatinga. Lasiodiplodia theobromae foi encontrada apenas na Mata Atlântica no período de seco, floresta em que a diversidade de fungos isolados foi maior. Entre os fungos endofíticos isolados, 18 fungos mostraram atividade contra pelo menos um microorganismo teste em um screening preliminar, e os melhores resultados foram obtidos com a espécie N. sphaerica (URM-6060) e P. maculans (URM-6061). Após a fermentação, apenas N. sphaerica apresentou atividade antibacteriana quando fermentada meio de cultura líquido Batata Dextrose e no meio semi-sólido arroz. Os extrato NsME e NsEAE foram ativos contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, com CMI variando entre 1.56 e 6.25 mg/mL e CMB variando entre 6.25 e 50 mg/mL. O melhor resultado foi observado contra Staphylococcus aureus, com CMI 1,56 mg/ml e CMB 6,25 mg/ml para NsME e CMI 0,39 mg/ml e CMB 3,12 mg/ml com o extrato NsEAE. O ácido indólico-3-carboxílico apresentou atividade fungicida contra todas as espécies de Candida testadas, com CMI variando entre 0.125 e 0.0039 mg/mL e concentração mínima fungicida (CMF) variando entre 0.125 e 0.0039 mg/mL, sendo os melhores resultados observados contra Candida guilermondii, C. haemulonii and C. albicans. Estes resultados representam o primeiro relato sobre a micobiota endofítica de I. suffruticosa demonstrando que as características da Mata Atlântica favorecem uma maior colonização de fungos endofíticos, em comparação com a Caatinga, em que o fungo N. sphaerica demonstrou ser capaz para produzir agentes bioativos com potencial uso farmacêutico na busca de novas fontes biológicas de candidatos a fármacos.