O folículo ovariano é composto pelo oócito (gameta feminino) e por várias camadas de células foliculares somáticas, sendo que destas, as mais intimamente associadas com o oócito são as células do cumulus oophorus (CCs), as quais estão em contato direto com o gameta feminino e formam o complexo cumulus-oócito (CCO), e as células murais da granulosa (CGs), que revestem a parede do folículo ovariano. Visto que estas CGs e CCs são facilmente acessadas durante tratamentos de reprodução assistida (RA), que podem ser coletadas sem comprometimento do oócito e que são descartadas após a recuperação do oócito é possível que elas sejam utilizadas em pesquisas que visam elucidar a fisiologia ovariana. No entanto, quando recuperadas, nos ciclos de reprodução assistida, estas células se encontram em um estado luteinizado, devido ao tratamento hormonal que as pacientes realizam. Sabe-se que o uso de CGs luteinizadas em cultura celular para o estudo do processo molecular ovulatório é limitado visto esta prévia exposição celular às gonadotrofinas e ao seu estado luteinizado. Porém, foi demonstrado que CGs luteinizadas podem readquirir sua capacidade de resposta à estimulação por gonadotrofinas, recuperando características semelhantes às daquelas de folículos não luteinizados nos estágios iniciais de diferenciação (early antral não luteinizado). A estimulação destas células com FSH causa aumento na expressão de genes que caracterizam CGs típicas de folículos pré-ovulatórios (pré-ovulatório não luteinizado). Ainda, outra questão importante com relação ao folículo ovariano diz respeito à ação dos androgênios nesta estrutura ovariana, sendo que já se sabe que a ativação do receptor de androgênio, localizado nas células foliculares, é capaz de modular a expressão e a atividade de genes importantes para a manutenção do desenvolvimento do folículo ovariano. Desta forma, sugere-se que o efeito reprodutivo do tratamento com dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (SDHEA), importantes androgênios, pode ser devido às suas ações justamente no microambiente folicular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a exposição de células foliculares desluteinizadas (estágios early antral e pré-ovulatório) ao SDHEA. Para isto, células da granulosa e do cumulus foram obtidas de pacientes submetidas à fertilização in vitro e foram cultivas separadamente. Inicialmente, fez-se a determinação do melhor tempo de cultivo deste modelo celular proposto, dentre 6, 8 ou 10 dias de cultivo. As análises de viabilidade celular realizadas mostraram que o melhor tempo para o cultivo primário folicular, para as próximas etapas do trabalho, seria de oito dias. Após, também por análises de viabilidade celular, a melhor dose de SDHEA para exposição às células foliculares foi determinada dentre cinco doses testadas em comparação a um controle sem exposição hormonal. As análises mostraram que a dose mais adequada a ser utilizada era a dose de 0,08 μM de SDHEA. Posteriormente, tendo definido o melhor tempo de cultivo e a dose ideal de exposição das células em questão ao SDHEA, os experimentos foram realizados com dois grupos experimentais distintos: células early antral não luteinizadas e células pré-ovulatórias não luteinizadas – expostas ao FSH. Ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: grupo controle (sem exposição hormonal) e grupo SDHEA (com exposição ao SDHEA). Foram feitas dosagens hormonais de SDHEA, de estradiol e de progesterona nos dias 1, 4, 6 e 8 do sobrenadante do cultivo celular. A análise ao longo do tempo mostrou que os valores das dosagens de SDHEA se mantiveram constantes no grupo controle durante todo o período de cultivo celular, não havendo diferença estatística entre as quatro dosagens hormonais feitas neste grupo. Por outro lado, no grupo tratado houve diferença nos valores deste hormônio nos dias 6 e 8, em comparação aos dias 1 e 4, devido justamente ao tratamento com SDHEA realizado neste grupo experimental. Com relação ao estradiol, independente do tipo celular e do estágio de desenvolvimento, foi possível ver que a sua secreção era elevada no primeiro dia de cultivo, diminuindo nos outros dias devido às condições e ao tempo de cultivo do protocolo de desluteinização celular. Além disso, as células tratadas com SDHEA apresentaram uma secreção de estradiol superior àquelas não tratadas. Por fim, as dosagens de progesterona revelaram que o tratamento com SDHEA não alterou a secreção deste hormônio pelas células, em nenhum dos dois estágios de desenvolvimento. Ainda, as células apresentaram uma secreção aumentada de progesterona no sexto dia de cultivo celular em comparação ao primeiro e ao quarto dia; porém, esta secreção começou a diminuir quando do oitavo dia de cultivo. Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o tratamento com SDHEA é capaz de aumentar a secreção de estradiol de células foliculares não luteinizadas, não alterando a secreção de progesterona dessas mesmas células. Mais estudos são necessários para um melhor entendimento dos efeitos do SDHEA nos processos que compõem a foliculogênese. / Ovarian follicle is formed by the oocyte (female gamete) and somatic follicular cells. Those closer to the oocyte are cumulus oophorus cells (CCs), which are in direct contact with the female gamete, and the granulosa mural cells (GCs), which form the wall of the ovarian follicle. As GCs and CCs are easily accessed during assisted reproduction procedures and are discarded after oocyte retrieval, they can be used in research aimed at elucidating ovarian physiology. However, when recovered in assisted reproduction cycles, these cells are in a luteinized state due patient hormonal treatment. It is known that the use of luteinized GCs to study the molecular ovulatory process is limited due to this prior cellular exposure to gonadotrophins and their luteinized state. However, luteinized CGs have been shown to reacquire similar characteristics to those of non-luteinized follicles in early stages of differentiation (non-luteinized early antral). Stimulation of these cells with follicle stimulating hormone (FSH) increases expression of genes that characterize CGs typical of pre ovulatory follicles (non-luteinized pre ovulatory). Another important question regarding the ovarian follicle relates to androgens action in this ovarian structure. As it is known, androgen receptor activation, located in follicular cells, is able to modulate expression and activity of important genes for the maintenance of ovarian follicle development. Thus, authors suggest that the reproductive effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) and their sulfate (SDHEA) treatment, important androgens, may be due their actions precisely in the follicular microenvironment. Consequently, the aim of this work was to analyze the exposure to SDHEA of non-luteinized follicular cells (early antral and pre-ovulatory stages). Granulosa and cumulus cells were obtained from patients submitted to in vitro fertilization and were separately cultivated. Initially, the best culture time of this proposed cellular model was determined among 6, 8 or 10 days of culture. Cellular viability analysis showed that primary follicular culture for the next steps of the study would be of 8 days. Thereafter, cellular viability assays were used to determine the best SDHEA dose among 5 doses to follicular cells exposure in comparison to a control without hormonal exposure. The analysis showed that the best dose to use was 0,08 μM of SDHEA. Subsequently, after defined the best culture time and the ideal exposure dose of the cells to SDHEA, experiments were performed with two different experimental groups: non-luteinized early antral cells and non-luteinized pre ovulatory cells – exposed to FSH. Both groups were divided in two subgroups: control group (no hormonal exposure) and SDHEA group (with SDHEA exposure). SDHEA, estradiol and progesterone hormonal dosages of the cell culture supernatant were done on days 1, 4, 6 and 8. Over time analysis revealed that SDHEA values were constant in control group during all the cell culture period, without statistical difference between the four hormonal dosages performed in this group. However, treated group showed a difference in the values of this hormone on days 6 and 8, compared to days 1 and 4, due to treatment with SDHEA of these experimental group . Regarding estradiol, independent of cell type and stage of development, it was possible to see that its secretion was high on the first day of culture, decreasing in others due to conditions and time of culture of the non-luteinized cells protocol. In addition, the SDHEA treated cells presented higher estradiol secretion than those not treated. Finally, progesterone dosages revealed that treatment with SDHEA did not alter this hormone secretion from the cells in either of the two development stages. Besides that, the cells had an increased progesterone secretion on the sixth cell culture day compared to first and fourth day; however, this secretion began to decrease on the eight day of culture. In conclusion, SDHEA treatment is able to increases the non-luteinized follicular cells secretion of estradiol, but it is not able to modify the progesterone secretion of the same cells. More studies are needed to better understand the effects of SDHEA on the process that make part of folliculogenesis.

O folículo ovariano é composto pelo oócito (gameta feminino) e por várias camadas de células foliculares somáticas, sendo que destas, as mais intimamente associadas com o oócito são as células do cumulus oophorus (CCs), as quais estão em contato direto com o gameta feminino e formam o complexo cumulus-oócito (CCO), e as células murais da granulosa (CGs), que revestem a parede do folículo ovariano. Visto que estas CGs e CCs são facilmente acessadas durante tratamentos de reprodução assistida (RA), que podem ser coletadas sem comprometimento do oócito e que são descartadas após a recuperação do oócito é possível que elas sejam utilizadas em pesquisas que visam elucidar a fisiologia ovariana. No entanto, quando recuperadas, nos ciclos de reprodução assistida, estas células se encontram em um estado luteinizado, devido ao tratamento hormonal que as pacientes realizam. Sabe-se que o uso de CGs luteinizadas em cultura celular para o estudo do processo molecular ovulatório é limitado visto esta prévia exposição celular às gonadotrofinas e ao seu estado luteinizado. Porém, foi demonstrado que CGs luteinizadas podem readquirir sua capacidade de resposta à estimulação por gonadotrofinas, recuperando características semelhantes às daquelas de folículos não luteinizados nos estágios iniciais de diferenciação (early antral não luteinizado). A estimulação destas células com FSH causa aumento na expressão de genes que caracterizam CGs típicas de folículos pré-ovulatórios (pré-ovulatório não luteinizado). Ainda, outra questão importante com relação ao folículo ovariano diz respeito à ação dos androgênios nesta estrutura ovariana, sendo que já se sabe que a ativação do receptor de androgênio, localizado nas células foliculares, é capaz de modular a expressão e a atividade de genes importantes para a manutenção do desenvolvimento do folículo ovariano. Desta forma, sugere-se que o efeito reprodutivo do tratamento com dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (SDHEA), importantes androgênios, pode ser devido às suas ações justamente no microambiente folicular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a exposição de células foliculares desluteinizadas (estágios early antral e pré-ovulatório) ao SDHEA. Para isto, células da granulosa e do cumulus foram obtidas de pacientes submetidas à fertilização in vitro e foram cultivas separadamente. Inicialmente, fez-se a determinação do melhor tempo de cultivo deste modelo celular proposto, dentre 6, 8 ou 10 dias de cultivo. As análises de viabilidade celular realizadas mostraram que o melhor tempo para o cultivo primário folicular, para as próximas etapas do trabalho, seria de oito dias. Após, também por análises de viabilidade celular, a melhor dose de SDHEA para exposição às células foliculares foi determinada dentre cinco doses testadas em comparação a um controle sem exposição hormonal. As análises mostraram que a dose mais adequada a ser utilizada era a dose de 0,08 μM de SDHEA. Posteriormente, tendo definido o melhor tempo de cultivo e a dose ideal de exposição das células em questão ao SDHEA, os experimentos foram realizados com dois grupos experimentais distintos: células early antral não luteinizadas e células pré-ovulatórias não luteinizadas – expostas ao FSH. Ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: grupo controle (sem exposição hormonal) e grupo SDHEA (com exposição ao SDHEA). Foram feitas dosagens hormonais de SDHEA, de estradiol e de progesterona nos dias 1, 4, 6 e 8 do sobrenadante do cultivo celular. A análise ao longo do tempo mostrou que os valores das dosagens de SDHEA se mantiveram constantes no grupo controle durante todo o período de cultivo celular, não havendo diferença estatística entre as quatro dosagens hormonais feitas neste grupo. Por outro lado, no grupo tratado houve diferença nos valores deste hormônio nos dias 6 e 8, em comparação aos dias 1 e 4, devido justamente ao tratamento com SDHEA realizado neste grupo experimental. Com relação ao estradiol, independente do tipo celular e do estágio de desenvolvimento, foi possível ver que a sua secreção era elevada no primeiro dia de cultivo, diminuindo nos outros dias devido às condições e ao tempo de cultivo do protocolo de desluteinização celular. Além disso, as células tratadas com SDHEA apresentaram uma secreção de estradiol superior àquelas não tratadas. Por fim, as dosagens de progesterona revelaram que o tratamento com SDHEA não alterou a secreção deste hormônio pelas células, em nenhum dos dois estágios de desenvolvimento. Ainda, as células apresentaram uma secreção aumentada de progesterona no sexto dia de cultivo celular em comparação ao primeiro e ao quarto dia; porém, esta secreção começou a diminuir quando do oitavo dia de cultivo. Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o tratamento com SDHEA é capaz de aumentar a secreção de estradiol de células foliculares não luteinizadas, não alterando a secreção de progesterona dessas mesmas células. Mais estudos são necessários para um melhor entendimento dos efeitos do SDHEA nos processos que compõem a foliculogênese. / Ovarian follicle is formed by the oocyte (female gamete) and somatic follicular cells. Those closer to the oocyte are cumulus oophorus cells (CCs), which are in direct contact with the female gamete, and the granulosa mural cells (GCs), which form the wall of the ovarian follicle. As GCs and CCs are easily accessed during assisted reproduction procedures and are discarded after oocyte retrieval, they can be used in research aimed at elucidating ovarian physiology. However, when recovered in assisted reproduction cycles, these cells are in a luteinized state due patient hormonal treatment. It is known that the use of luteinized GCs to study the molecular ovulatory process is limited due to this prior cellular exposure to gonadotrophins and their luteinized state. However, luteinized CGs have been shown to reacquire similar characteristics to those of non-luteinized follicles in early stages of differentiation (non-luteinized early antral). Stimulation of these cells with follicle stimulating hormone (FSH) increases expression of genes that characterize CGs typical of pre ovulatory follicles (non-luteinized pre ovulatory). Another important question regarding the ovarian follicle relates to androgens action in this ovarian structure. As it is known, androgen receptor activation, located in follicular cells, is able to modulate expression and activity of important genes for the maintenance of ovarian follicle development. Thus, authors suggest that the reproductive effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) and their sulfate (SDHEA) treatment, important androgens, may be due their actions precisely in the follicular microenvironment. Consequently, the aim of this work was to analyze the exposure to SDHEA of non-luteinized follicular cells (early antral and pre-ovulatory stages). Granulosa and cumulus cells were obtained from patients submitted to in vitro fertilization and were separately cultivated. Initially, the best culture time of this proposed cellular model was determined among 6, 8 or 10 days of culture. Cellular viability analysis showed that primary follicular culture for the next steps of the study would be of 8 days. Thereafter, cellular viability assays were used to determine the best SDHEA dose among 5 doses to follicular cells exposure in comparison to a control without hormonal exposure. The analysis showed that the best dose to use was 0,08 μM of SDHEA. Subsequently, after defined the best culture time and the ideal exposure dose of the cells to SDHEA, experiments were performed with two different experimental groups: non-luteinized early antral cells and non-luteinized pre ovulatory cells – exposed to FSH. Both groups were divided in two subgroups: control group (no hormonal exposure) and SDHEA group (with SDHEA exposure). SDHEA, estradiol and progesterone hormonal dosages of the cell culture supernatant were done on days 1, 4, 6 and 8. Over time analysis revealed that SDHEA values were constant in control group during all the cell culture period, without statistical difference between the four hormonal dosages performed in this group. However, treated group showed a difference in the values of this hormone on days 6 and 8, compared to days 1 and 4, due to treatment with SDHEA of these experimental group . Regarding estradiol, independent of cell type and stage of development, it was possible to see that its secretion was high on the first day of culture, decreasing in others due to conditions and time of culture of the non-luteinized cells protocol. In addition, the SDHEA treated cells presented higher estradiol secretion than those not treated. Finally, progesterone dosages revealed that treatment with SDHEA did not alter this hormone secretion from the cells in either of the two development stages. Besides that, the cells had an increased progesterone secretion on the sixth cell culture day compared to first and fourth day; however, this secretion began to decrease on the eight day of culture. In conclusion, SDHEA treatment is able to increases the non-luteinized follicular cells secretion of estradiol, but it is not able to modify the progesterone secretion of the same cells. More studies are needed to better understand the effects of SDHEA on the process that make part of folliculogenesis.

O folículo ovariano é composto pelo oócito (gameta feminino) e por várias camadas de células foliculares somáticas, sendo que destas, as mais intimamente associadas com o oócito são as células do cumulus oophorus (CCs), as quais estão em contato direto com o gameta feminino e formam o complexo cumulus-oócito (CCO), e as células murais da granulosa (CGs), que revestem a parede do folículo ovariano. Visto que estas CGs e CCs são facilmente acessadas durante tratamentos de reprodução assistida (RA), que podem ser coletadas sem comprometimento do oócito e que são descartadas após a recuperação do oócito é possível que elas sejam utilizadas em pesquisas que visam elucidar a fisiologia ovariana. No entanto, quando recuperadas, nos ciclos de reprodução assistida, estas células se encontram em um estado luteinizado, devido ao tratamento hormonal que as pacientes realizam. Sabe-se que o uso de CGs luteinizadas em cultura celular para o estudo do processo molecular ovulatório é limitado visto esta prévia exposição celular às gonadotrofinas e ao seu estado luteinizado. Porém, foi demonstrado que CGs luteinizadas podem readquirir sua capacidade de resposta à estimulação por gonadotrofinas, recuperando características semelhantes às daquelas de folículos não luteinizados nos estágios iniciais de diferenciação (early antral não luteinizado). A estimulação destas células com FSH causa aumento na expressão de genes que caracterizam CGs típicas de folículos pré-ovulatórios (pré-ovulatório não luteinizado). Ainda, outra questão importante com relação ao folículo ovariano diz respeito à ação dos androgênios nesta estrutura ovariana, sendo que já se sabe que a ativação do receptor de androgênio, localizado nas células foliculares, é capaz de modular a expressão e a atividade de genes importantes para a manutenção do desenvolvimento do folículo ovariano. Desta forma, sugere-se que o efeito reprodutivo do tratamento com dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (SDHEA), importantes androgênios, pode ser devido às suas ações justamente no microambiente folicular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a exposição de células foliculares desluteinizadas (estágios early antral e pré-ovulatório) ao SDHEA. Para isto, células da granulosa e do cumulus foram obtidas de pacientes submetidas à fertilização in vitro e foram cultivas separadamente. Inicialmente, fez-se a determinação do melhor tempo de cultivo deste modelo celular proposto, dentre 6, 8 ou 10 dias de cultivo. As análises de viabilidade celular realizadas mostraram que o melhor tempo para o cultivo primário folicular, para as próximas etapas do trabalho, seria de oito dias. Após, também por análises de viabilidade celular, a melhor dose de SDHEA para exposição às células foliculares foi determinada dentre cinco doses testadas em comparação a um controle sem exposição hormonal. As análises mostraram que a dose mais adequada a ser utilizada era a dose de 0,08 μM de SDHEA. Posteriormente, tendo definido o melhor tempo de cultivo e a dose ideal de exposição das células em questão ao SDHEA, os experimentos foram realizados com dois grupos experimentais distintos: células early antral não luteinizadas e células pré-ovulatórias não luteinizadas – expostas ao FSH. Ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: grupo controle (sem exposição hormonal) e grupo SDHEA (com exposição ao SDHEA). Foram feitas dosagens hormonais de SDHEA, de estradiol e de progesterona nos dias 1, 4, 6 e 8 do sobrenadante do cultivo celular. A análise ao longo do tempo mostrou que os valores das dosagens de SDHEA se mantiveram constantes no grupo controle durante todo o período de cultivo celular, não havendo diferença estatística entre as quatro dosagens hormonais feitas neste grupo. Por outro lado, no grupo tratado houve diferença nos valores deste hormônio nos dias 6 e 8, em comparação aos dias 1 e 4, devido justamente ao tratamento com SDHEA realizado neste grupo experimental. Com relação ao estradiol, independente do tipo celular e do estágio de desenvolvimento, foi possível ver que a sua secreção era elevada no primeiro dia de cultivo, diminuindo nos outros dias devido às condições e ao tempo de cultivo do protocolo de desluteinização celular. Além disso, as células tratadas com SDHEA apresentaram uma secreção de estradiol superior àquelas não tratadas. Por fim, as dosagens de progesterona revelaram que o tratamento com SDHEA não alterou a secreção deste hormônio pelas células, em nenhum dos dois estágios de desenvolvimento. Ainda, as células apresentaram uma secreção aumentada de progesterona no sexto dia de cultivo celular em comparação ao primeiro e ao quarto dia; porém, esta secreção começou a diminuir quando do oitavo dia de cultivo. Tendo em vista os resultados obtidos, podemos concluir que o tratamento com SDHEA é capaz de aumentar a secreção de estradiol de células foliculares não luteinizadas, não alterando a secreção de progesterona dessas mesmas células. Mais estudos são necessários para um melhor entendimento dos efeitos do SDHEA nos processos que compõem a foliculogênese. / Ovarian follicle is formed by the oocyte (female gamete) and somatic follicular cells. Those closer to the oocyte are cumulus oophorus cells (CCs), which are in direct contact with the female gamete, and the granulosa mural cells (GCs), which form the wall of the ovarian follicle. As GCs and CCs are easily accessed during assisted reproduction procedures and are discarded after oocyte retrieval, they can be used in research aimed at elucidating ovarian physiology. However, when recovered in assisted reproduction cycles, these cells are in a luteinized state due patient hormonal treatment. It is known that the use of luteinized GCs to study the molecular ovulatory process is limited due to this prior cellular exposure to gonadotrophins and their luteinized state. However, luteinized CGs have been shown to reacquire similar characteristics to those of non-luteinized follicles in early stages of differentiation (non-luteinized early antral). Stimulation of these cells with follicle stimulating hormone (FSH) increases expression of genes that characterize CGs typical of pre ovulatory follicles (non-luteinized pre ovulatory). Another important question regarding the ovarian follicle relates to androgens action in this ovarian structure. As it is known, androgen receptor activation, located in follicular cells, is able to modulate expression and activity of important genes for the maintenance of ovarian follicle development. Thus, authors suggest that the reproductive effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) and their sulfate (SDHEA) treatment, important androgens, may be due their actions precisely in the follicular microenvironment. Consequently, the aim of this work was to analyze the exposure to SDHEA of non-luteinized follicular cells (early antral and pre-ovulatory stages). Granulosa and cumulus cells were obtained from patients submitted to in vitro fertilization and were separately cultivated. Initially, the best culture time of this proposed cellular model was determined among 6, 8 or 10 days of culture. Cellular viability analysis showed that primary follicular culture for the next steps of the study would be of 8 days. Thereafter, cellular viability assays were used to determine the best SDHEA dose among 5 doses to follicular cells exposure in comparison to a control without hormonal exposure. The analysis showed that the best dose to use was 0,08 μM of SDHEA. Subsequently, after defined the best culture time and the ideal exposure dose of the cells to SDHEA, experiments were performed with two different experimental groups: non-luteinized early antral cells and non-luteinized pre ovulatory cells – exposed to FSH. Both groups were divided in two subgroups: control group (no hormonal exposure) and SDHEA group (with SDHEA exposure). SDHEA, estradiol and progesterone hormonal dosages of the cell culture supernatant were done on days 1, 4, 6 and 8. Over time analysis revealed that SDHEA values were constant in control group during all the cell culture period, without statistical difference between the four hormonal dosages performed in this group. However, treated group showed a difference in the values of this hormone on days 6 and 8, compared to days 1 and 4, due to treatment with SDHEA of these experimental group . Regarding estradiol, independent of cell type and stage of development, it was possible to see that its secretion was high on the first day of culture, decreasing in others due to conditions and time of culture of the non-luteinized cells protocol. In addition, the SDHEA treated cells presented higher estradiol secretion than those not treated. Finally, progesterone dosages revealed that treatment with SDHEA did not alter this hormone secretion from the cells in either of the two development stages. Besides that, the cells had an increased progesterone secretion on the sixth cell culture day compared to first and fourth day; however, this secretion began to decrease on the eight day of culture. In conclusion, SDHEA treatment is able to increases the non-luteinized follicular cells secretion of estradiol, but it is not able to modify the progesterone secretion of the same cells. More studies are needed to better understand the effects of SDHEA on the process that make part of folliculogenesis.