Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-29 / Centro de Integração Empresa Escola (CIEE) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundação de Apoio e Desenvolvimento ao Ensino, Pesquisa e Extensão Universitária no Acre (FUNDAPE) / Nesta dissertação são apresentados dois estudos envolvendo isolados clínicos de Acinetobacter baumannii que apresentaram mecanismos enzimáticos de resistência aos carbapenêmicos, a produção de carbapenemases do tipo OXA. O primeiro estudo avalia a relação genética de amostras de A. baumannii multirresistentes produtoras de OXA-23 provenientes de distintas cidades brasileiras. 91 amostras clínicas de A. baumannii foram isoladas em 17 centros médicos localizados nas cidades de São Paulo (SP), Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Porto Alegre (RS), Blumenau (SC), Curitiba (PR), São Luiz (MA) e Salvador (BA). Nesta coleção observamos altas taxas de resistência aos carbapenêmicos (91.2%) e presença do gene blaOXA-23-like em 83,5% dos isolados. O elemento de insersão ISAba1 à montante ao gene blaOXA-23 foi detectado em todos os 76 isolados de A. baumannii produtores de OXA-23. Nove grupos de genótipos foram observados entre os 76 isolados produtores de OXA-23. Nossos achados sugerem que o gene blaOXA-23 presente nestes isolados estava localizado DNA cromossomal. Três principais grupos (A, B e D) foram observados circulando em seis cidades das regiões sudeste e sul do Brasil, sendo que o genótipo predominante (A) apresentou relação clonal àquele primeiramente descrito na cidade de Curitiba, em 2003. Em contrapartida foi encontrado um único genótipo de A. baumannii produtor de OXA-23 na cidade de São Luís. Embora existam estudos brasileiros prévios reportando a disseminação de clones de A. baumannii pordutores de OXA-23 localmente, nenhum estudo brasileiro demonstrou antes, i) a análise comparativa dos genótipos originários de diferentes e distantes cidades brasileiras, ii) a provável localização do gene blaOXA-23 e iii) a presença do elemento ISAba1 à montante ao gene blaOXA-23,o que pode ter levado ao alto grau de resistência aos carbapenens observado. Desta maneira, o estudo demonstra a circulação de clones de A. baumannii produtores de OXA-23 no Brasil e enfatiza que medidas de controle de infecção são urgentemente necessárias para reduzir tanto a disseminação de isolados multirresistenes quanto o número de infecções causadas por este patógeno. O segundo estudo trata de um relato de caso de um paciente internado em um hospital da cidade de São Paulo, que apresentou uma infecção por A. baumannii produtor de OXA-72. O isolado em questão, A 30235, apresentou resistência a todos os antimicrobianos testados, com excessão à ampicilina/sulbactam tendo apresentado redução da sensibilidade a esta associação. Foi realizada com sucesso a transformação do plasmídeo presente no isolado A30235 na cepa de A. baumannii ATCC 19606. A confirmação da presença do gene blaOXA-72 no transformante evidenciou a localização plasmidial deste determinante de resistência. O plasmídio contendo o gene blaOXA-72 apresentou um peso molecular de aproximadamente 86 Kb. Neste estudo identificamos pela primeira vez no Brasil, um isolado clínico de A. baumannii produtor de OXA-72. A presença deste determinante de resistência codificado por um gene localizado em um elemento genético móvel demonstra a crescente diversidade de carbapenemase do tipo OXA no Brasil com potencial de disseminação. Medidas de controles adequadas deverão ser tomadas para evitar a disseminação de isolados produtores de OXA-72 entre os hospitais brasileiros, o que tem ocorrido com os isolados de A. baumannii produtor de OXA-23. / In this dissertation we present two studies involving carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates due to the production of carbapenems modifying enzymes, the OXA-type carbapenemases. The first study aimed to determine the genetic relationship of multi-drug-resistant A. baumannii producing OXA-23 that was isolated in distinct Brazilian cities. A total of 91 A. baumannii clinical isolates were recovered from 17 medical centers located at eight cities, namely São Paulo (SP), Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Porto Alegre (RS), Blumenau (SC), Curitiba (PR), São Luiz (MA) and Salvador (BA). In this collection we observed high rates of carbapenems resistance (91.2%). Also, the blaOXA- 23-like gene was present in 83.5% of isolates. The insertion sequence ISAba1 was positioned upstream the blaOXA-23 gene in all OXA-23-producing A. baumannii identified. Nine clusters were observed among OXA-23 producers. Our fidings suggest that the blaOXA-23 gene was probably chromosomally-located in all isolates studied. Three clusters (A, B and D) were found in six cities from southeast and southern reagions of Brazil. In addition, the predominant cluster (A) was clonally related to that first described in Curitiba, in2003. In contrast, a single cluster of A. baumannii producing OXA-23 was found in São Luís city. Although there were previous reports regarding the spread of OXA-23-producing A. baumannii in Brazil the following features had not yet been assessed: i) the comparative analysis of OXA-23 producers genotypes originating in distinct and distant Brazilian cities, ii) the genetic location of the blaOXA-23 gene and iii) the presence of ISAba1 upstream blaOXA-23 probably resulting in high degree of carbapenem resistance. Thus, our study demonstrates that the clonal dissemination of OXA-23- producing A. baumannii had occurred in Brazil. These findings emphasize that infection control measures are urgently needed to reduce both the spread of multidrug resistantstrains and the number of infections caused by this pathogen. The second study refers to a case report involving a hospitalized patient that presented an wound infection due to OXA-72-producing A. baumannii. The referred clinical isolate, A 30235, was resistant to most antibiotics tested and showed reduced susctptibility to ampicillin/sulbactam. Successful transformation assays using A. baumannii ATCC 19606 as the recipient strain revealed the plasmid location of the blaOXA-72 gene. This plasmid showed molecular weight of about 86 Kb. We identified for the first time in Brazil, an A. baumannii clinical isolate producing OXA-72. The presence of this resistance determinant encoded by a gene located in a mobile genetic elemet, points out to an increasing diversity of OXA-type carbapenemase in Brazil with potential spread. Appropriate control measures should be taken to prevent the spread of OXA-72 producers among Brazilian hospitals, which it we have experienced with OXA-23- producing-A. baumannii in this country. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Introdução: O gênero Acinetobacter representa um importante patógeno relacionado a infecções hospitalares, principalmente, à pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV). O aumento de isolados de Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos (ABRC) representa um problema mundial, pois limita drasticamente as opções terapêuticas. A produção da carbapenamase OXA-23, uma β-lactamase da classe D de Ambler, representa o principal mecanismo responsável por esta resistência em nosso país. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo padronizar a técnica de PCR em tempo real (qPCR) para a detecção do gene blaOXA-23 diretamente de aspirados traqueais (ATs) de pacientes com suspeita de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) de unidades de tratamento intensivo (UTIs). Métodos e resultados: O DNA das amostras de ATs coletadas de pacientes em ventilação mecânica foi analisado pela técnica de qPCR, utilizando o SYBR green, para a detecção do gene blaOXA-23. Dentre os 20 ATs analisados, ABRC foi isolado em 10, A. baumannii sensível aos carbapemêmicos (ABSC) em 3 e 7 foram negativos na culura bacteriológica. O gene blaOXA-23 foi detectado tanto na colônia quanto no AT em 8 das 10 amostras de ABRC. Em uma amostra não houve detecção do gene por qPCR em nenhum dos materiais e em outra amostra houve detecção só no AT. Dos ABSC, em duas amostras não houve detecção do gene na colônia e no AT enquanto que em uma amostra o gene foi detectado somente no AT. Em nenhuma das amostras de ATs negativas na cultura foi detectado o gene. Conclusão: O estudo sugere que a técnica qPCR pode ser aplicada para a detecção do gene blaoxa-23 diretamente de amostras de AT, reduzindo assim, o tempo para o início de uma terpia antimicrobiana adequada e melhorando, consequentemente, o desfecho clínico deste pacientes. / Background: The genus Acinetobacter is an important pathogen associated with nosocomial infections mainly ventilator-associated pneumonia (VAP). The increasing of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii (CRAB) isolates is a worldwide concern since it limits drastically the range of therapeutic alternatives. The OXA-23 producing, a carbapenemhydrolysing class D β-lactamase, is the major mechanism responsible for CRAB in our country. Objective: The study objective is to develop a real time PCR (qPCR) to detect the Acinetobacter baumannii blaOXA-23 gene directly in endotracheal aspirate (ETA) of patients under mechanical ventilation, with suspected ventilator-associated pneumonia (VAP). Methods and Results: DNA extracted from ETA samples from patients under mechanical ventilation was analyzed by qPCR, using SYBR green, for the presence of blaOXA-23 gene. Among the 20 ETAs examined, CRAB isolates were recovered in 10 quantitative cultures; carbapenem-susceptible A. baumannii (CSAB) in 3 and 7 cultures were negative to A. baumanni. Of the 10 CRAB, 8 were positive for blaOXA-23 on both the colony and ETA. In one blaOXA-23 qPCR was negative in colony and directly from ETA, while the other showed a qPCR negative result in the colony and positive in the ETA. In 3 CSAB, 2 samples showed negative results in colony and ETA and one showed a blaOXA-23 positive result only from the ETA. None of the 7 negative ETAs were positive for blaOXA-23 gene in the qPCR of the ETA. Conclusion: Our study suggests that qPCR can be applied to detect the presence of blaOXA-23 gene directly from ETAs reducing the time to an earlier initiation of appropriate therapy improving, consequently, the clinical outcomes for these patients.

Introdução: O gênero Acinetobacter representa um importante patógeno relacionado a infecções hospitalares, principalmente, à pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV). O aumento de isolados de Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos (ABRC) representa um problema mundial, pois limita drasticamente as opções terapêuticas. A produção da carbapenamase OXA-23, uma β-lactamase da classe D de Ambler, representa o principal mecanismo responsável por esta resistência em nosso país. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo padronizar a técnica de PCR em tempo real (qPCR) para a detecção do gene blaOXA-23 diretamente de aspirados traqueais (ATs) de pacientes com suspeita de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) de unidades de tratamento intensivo (UTIs). Métodos e resultados: O DNA das amostras de ATs coletadas de pacientes em ventilação mecânica foi analisado pela técnica de qPCR, utilizando o SYBR green, para a detecção do gene blaOXA-23. Dentre os 20 ATs analisados, ABRC foi isolado em 10, A. baumannii sensível aos carbapemêmicos (ABSC) em 3 e 7 foram negativos na culura bacteriológica. O gene blaOXA-23 foi detectado tanto na colônia quanto no AT em 8 das 10 amostras de ABRC. Em uma amostra não houve detecção do gene por qPCR em nenhum dos materiais e em outra amostra houve detecção só no AT. Dos ABSC, em duas amostras não houve detecção do gene na colônia e no AT enquanto que em uma amostra o gene foi detectado somente no AT. Em nenhuma das amostras de ATs negativas na cultura foi detectado o gene. Conclusão: O estudo sugere que a técnica qPCR pode ser aplicada para a detecção do gene blaoxa-23 diretamente de amostras de AT, reduzindo assim, o tempo para o início de uma terpia antimicrobiana adequada e melhorando, consequentemente, o desfecho clínico deste pacientes. / Background: The genus Acinetobacter is an important pathogen associated with nosocomial infections mainly ventilator-associated pneumonia (VAP). The increasing of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii (CRAB) isolates is a worldwide concern since it limits drastically the range of therapeutic alternatives. The OXA-23 producing, a carbapenemhydrolysing class D β-lactamase, is the major mechanism responsible for CRAB in our country. Objective: The study objective is to develop a real time PCR (qPCR) to detect the Acinetobacter baumannii blaOXA-23 gene directly in endotracheal aspirate (ETA) of patients under mechanical ventilation, with suspected ventilator-associated pneumonia (VAP). Methods and Results: DNA extracted from ETA samples from patients under mechanical ventilation was analyzed by qPCR, using SYBR green, for the presence of blaOXA-23 gene. Among the 20 ETAs examined, CRAB isolates were recovered in 10 quantitative cultures; carbapenem-susceptible A. baumannii (CSAB) in 3 and 7 cultures were negative to A. baumanni. Of the 10 CRAB, 8 were positive for blaOXA-23 on both the colony and ETA. In one blaOXA-23 qPCR was negative in colony and directly from ETA, while the other showed a qPCR negative result in the colony and positive in the ETA. In 3 CSAB, 2 samples showed negative results in colony and ETA and one showed a blaOXA-23 positive result only from the ETA. None of the 7 negative ETAs were positive for blaOXA-23 gene in the qPCR of the ETA. Conclusion: Our study suggests that qPCR can be applied to detect the presence of blaOXA-23 gene directly from ETAs reducing the time to an earlier initiation of appropriate therapy improving, consequently, the clinical outcomes for these patients.

Introdução: O gênero Acinetobacter representa um importante patógeno relacionado a infecções hospitalares, principalmente, à pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV). O aumento de isolados de Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos (ABRC) representa um problema mundial, pois limita drasticamente as opções terapêuticas. A produção da carbapenamase OXA-23, uma β-lactamase da classe D de Ambler, representa o principal mecanismo responsável por esta resistência em nosso país. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo padronizar a técnica de PCR em tempo real (qPCR) para a detecção do gene blaOXA-23 diretamente de aspirados traqueais (ATs) de pacientes com suspeita de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) de unidades de tratamento intensivo (UTIs). Métodos e resultados: O DNA das amostras de ATs coletadas de pacientes em ventilação mecânica foi analisado pela técnica de qPCR, utilizando o SYBR green, para a detecção do gene blaOXA-23. Dentre os 20 ATs analisados, ABRC foi isolado em 10, A. baumannii sensível aos carbapemêmicos (ABSC) em 3 e 7 foram negativos na culura bacteriológica. O gene blaOXA-23 foi detectado tanto na colônia quanto no AT em 8 das 10 amostras de ABRC. Em uma amostra não houve detecção do gene por qPCR em nenhum dos materiais e em outra amostra houve detecção só no AT. Dos ABSC, em duas amostras não houve detecção do gene na colônia e no AT enquanto que em uma amostra o gene foi detectado somente no AT. Em nenhuma das amostras de ATs negativas na cultura foi detectado o gene. Conclusão: O estudo sugere que a técnica qPCR pode ser aplicada para a detecção do gene blaoxa-23 diretamente de amostras de AT, reduzindo assim, o tempo para o início de uma terpia antimicrobiana adequada e melhorando, consequentemente, o desfecho clínico deste pacientes. / Background: The genus Acinetobacter is an important pathogen associated with nosocomial infections mainly ventilator-associated pneumonia (VAP). The increasing of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii (CRAB) isolates is a worldwide concern since it limits drastically the range of therapeutic alternatives. The OXA-23 producing, a carbapenemhydrolysing class D β-lactamase, is the major mechanism responsible for CRAB in our country. Objective: The study objective is to develop a real time PCR (qPCR) to detect the Acinetobacter baumannii blaOXA-23 gene directly in endotracheal aspirate (ETA) of patients under mechanical ventilation, with suspected ventilator-associated pneumonia (VAP). Methods and Results: DNA extracted from ETA samples from patients under mechanical ventilation was analyzed by qPCR, using SYBR green, for the presence of blaOXA-23 gene. Among the 20 ETAs examined, CRAB isolates were recovered in 10 quantitative cultures; carbapenem-susceptible A. baumannii (CSAB) in 3 and 7 cultures were negative to A. baumanni. Of the 10 CRAB, 8 were positive for blaOXA-23 on both the colony and ETA. In one blaOXA-23 qPCR was negative in colony and directly from ETA, while the other showed a qPCR negative result in the colony and positive in the ETA. In 3 CSAB, 2 samples showed negative results in colony and ETA and one showed a blaOXA-23 positive result only from the ETA. None of the 7 negative ETAs were positive for blaOXA-23 gene in the qPCR of the ETA. Conclusion: Our study suggests that qPCR can be applied to detect the presence of blaOXA-23 gene directly from ETAs reducing the time to an earlier initiation of appropriate therapy improving, consequently, the clinical outcomes for these patients.