Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Bibliogr.: f. 110-112. Publié aussi en version électronique.

Les interactions entre les plantes et les agents pathogènes fongiques conduisent habituellement à la mise en place par l’hôte de différents mécanismes de défense. Des exemples de ces mécanismes sont le renforcement de la paroi cellulaire par la subérine, la lignine et les composés phénoliques pariétaux, ainsi que l’accumulation de protéines PR et la production de phytoalexines qui peuvent être toxiques pour l’agent pathogène. Chez les plantes susceptibles, ces mécanismes ne réussissent pas à empêcher le développement de la maladie. La maladie hollandaise de l’orme est une maladie à caractère épidémique qui a causé la mort de millions d’ormes en Europe et en Amérique du Nord. Les bases moléculaires de cette maladie sont encore peu connues. Afin d’identifier des gènes impliqués dans l’interaction entre l’espèce susceptible Ulmus americana L. et son champignon pathogène Ophiostoma novo-ulmi Brasier, un système in vitro a été mis au point, celui-ci utilisant des cultures de cals auxquelles des cellules levuriformes du champignon ont été inoculées. Afin de valider son utilisation pour l’analyse génomique, ce système a d’abord fait l’objet d’une analyse histopathologique en microscopie photonique et électronique. Le développement du champignon dans les cals et les réactions de défenses de ces derniers face à la présence du champignon ont été observés à 4, 24 48, 72 et 96 heures post-inoculation (hpi). Le champignon a été détecté sous forme de réseau d’hyphes dans toutes les parties du cal à partir de 48 hpi. Les tests histochimiques ont montré l’importance de certaines réactions telles que l’accumulation de phénols, de lignine et de subérine dans les cellules des cals. Le pourcentage de cellules subérisées était 4,6 fois plus élevé à 96 hpi dans les cals infectés que dans les cals témoins. Une banque d’ADN complémentaire a été construite à partir de cals infectés (72 hpi) en utilisant la technique des hybridations suppressives et soustractives (SSH). Un total de 535 étiquettes de séquences exprimées (EST) a été obtenu et déposé dans la banque de données Genbank suite au séquençage partiel des clones. Ces étiquettes ont été regroupées en 314 uniséquences dont la majorité correspondait à des gènes d’orme identifiés durant l’interaction. Cinquante-trois uniséquences représentant des gènes impliqués dans différentes voies métaboliques associées à la défense ont été sélectionnées par un criblage différentiel et considérées comme étant induites durant l’interaction. Les profils d’expression à différents temps après inoculation ont été établis par PCR quantitative chez 18 uniséquences provenant de cals infectés ainsi que de cals traités à l’eau stérile. Ils confirment l’induction ou l’expression constitutive des gènes correspondants durant le processus de l’infection. Cette étude fournit pour la première fois une ressource génomique pour l’orme et révèle des mécanismes moléculaires impliqués dans l’interaction entre l’orme américain et l’agent pathogène responsable de la maladie hollandaise de l’orme. / Interactions between plants and fungal pathogens usually lead to the induction of different host defense mechanisms. Some of these mechanisms are the reinforcement of the plant cell wall by suberin, lignin and wall bound-phenolics, the accumulation of pathogenesis-related proteins, and the production of phytoalexins that could be toxic to the pathogen. Yet in susceptible plants, these mechanisms are not effective to produce resistance and disease develops. Dutch elm disease (DED) is a pandemic tree disease that killed millions of elm trees, especially in North America and Europe. The molecular bases of this disease are still poorly understood. With the objective of identifying genes involved in the interaction between the susceptible Ulmus americana L. and the pathogen Ophiostoma novo-ulmi Brasier, an in vitro system was developed using callus cultures inoculated with budding cells of the fungus. In order to validate the use of this system for genomic analyses of the interaction, a histopathological analysis was carried out using light and electron microscopy. Fungal colonization of the callus tissue and reactions of callus cells to the presence of the pathogen were observed at 4, 24, 48, 72 and 96 hours post-inoculation (hpi). The fungus was seen in its hyphal form by 48 hpi in all parts of the callus. Histochemical tests showed the importance of host reactions such as the accumulation of phenols, lignin, and suberin. The percentage of suberized cells was 4.6 times higher at 96 hpi in infected calli than in mock-inoculated control calli. A cDNA library using suppression subtractive hybridization (SSH) was constructed from infected elm callus tissue harvested at 72 hpi. A total of 535 expressed sequence tags were generated through partial sequencing and submitted to Genbank. These were grouped into 314 unisequences, the majority corresponding to elm genes identified during the interaction. Fifty-three unisequences representing genes involved in different pathways associated with plant defense were selected by differential screening and considered upregulated in the infected tissues. The expression profiles in mock and infected elm callus cultures of a subset of 18 elm genes were analyzed in more detail by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction. These confirmed upregulation and constitutive expression of selected genes during the infection process. This study provides, for the first time, a genome-wide resource for the elm, and furthermore identifies molecular mechanisms likely involved during the interaction between U. americana and the DED pathogen.

Hylurgopinus rufipes, the native elm bark beetle (NEBB), is the major vector of Dutch elm disease (DED) in Manitoba. Dissections of American elms (Ulmus americana), in the same year as DED symptoms appeared in them, showed that NEBB constructed brood galleries in which a generation completed development, and adult NEBB carrying DED spores would probably leave the newly-symptomatic trees. Rapid removal of freshly diseased trees, completed by mid-August, will prevent spore-bearing NEBB emergence, and is recommended. The relationship between presence of NEBB in stained branch sections and the total number of NEEB per tree could be the basis for methods to prioritize trees for rapid removal. Numbers and densities of overwintering NEBB in elm trees decreased with increasing height, with >70% of the population overwintering above ground doing so in the basal 15 cm. Substantial numbers of NEBB overwinter below the soil surface, and could be unaffected by basal spraying. Mark-recapture studies showed that frequency of spore bearing by overwintering beetles averaged 45% for the wild population and 2% for marked NEBB released from disease-free logs. Most NEBB overwintered close to their emergence site, but some traveled ≥4.8 km before wintering. Studies comparing efficacy of insecticides showed that chlorpyrifos gave 100% control of overwintering NEBB for two years as did bifenthrin: however, permethrin and carbaryl provided transient efficacy. NEBB showed a gradual increase in development rate with increasing constant temperature. Lipid content of overwintering NEBB was higher in late fall than in mid-winter, which might show that depletion of fat reserves could jeopardize survival, but could be a result of conversion to cryoprotectants.

L’orme, un arbre très apprécié pour le paysagisme urbain, est menacé par des champignons ophiostomatoïdes causant la maladie hollandaise de l'orme (MHO). Dans le xylème de l’orme, ces champignons se répandent passivement grâce à leurs cellules levuriformes bourgeonnantes et se servent de la forme mycélienne pour progresser dans les vaisseaux non infectés. Ce dimorphisme pourrait faciliter la colonisation de l’hôte, ce qui indique une possible liaison avec la virulence. Plusieurs stimuli affectent le dimorphisme, y compris des inhibiteurs de lipoxygénases. Les lipoxygénases (Lox), ainsi que les cyclooxygénases (Cox) sont des dioxygénases qui catalysent la formation d’oxylipines à partir d’acide gras. Ces molécules modulent le développement fongique et agissent possiblement dans le dimorphisme et la virulence des Ophiostoma. L’objectif de cette thèse est d’analyser le dimorphisme des agents de la MHO et vérifier si cette transition et la pathogénie sont modulées par des gènes qui encodent des enzymes du groupe des dioxygénases. Nous avons examiné l’effet de différents stimuli sur le dimorphisme des souches d’ophiostomatoïdes qui causent la MHO. Nous avons aussi vérifié si l’acide linoléique induit la transition de levure-mycélium et la formation de structures de reproduction chez ces agents. Également, nous avons identifié et caractérisé des gènes qui encodent des dioxygénases chez les génomes d’O. novo-ulmi H327 et d’O. ulmi W9. De plus, nous avons produit une souche Δppo1 d’O. novo-ulmi pour explorer la fonction de ce gène. Cette transition est probablement modulée par différents mécanismes et voies car la réponse à la manipulation de stimuli variait selon la souche analysée. L’acide salicylique, inhibiteur de cyclooxygénases, réduit la production de mycélium chez les souches testées. Néanmoins, l'acide linoléique a stimulé la formation de mycélium ainsi que la production des structures de reproduction. Aucun gène lox mais deux gènes cox sont présents dans les génomes d’O. novo-ulmi H327 et d’O. ulmi W9. Selon nos résultats, un de ces gènes cox (gène ppo1 ou g7173) ne semble pas lié à la virulence ni aux fonctions essentielles du cycle de vie d’O. novo-ulmi. Toutefois, les mutants Δppo1 produisent moins de mycélium que les souches sauvages en milieu liquide contenant de l’arginine. D’après nos résultats, les cyclooxygénases pourraient être liées au dimorphisme des agents de la MHO. / Elm trees, which are valued for urban landscaping, are threatened by ophiostomatoid fungi causing Dutch elm disease (DED). These fungi are transported passively in the elm xylem as yeast-budding cells and switch to the mycelial form to progress in uninfected vessels. This dimorphism may facilitate colonization of the host, which indicates its possible association with fungal virulence. Several stimuli affect dimorphism, among them lipoxygenase inhibitors. Lipoxygenase (Lox) and cyclooxygenase (Cox) are dioxygenases which catalyze oxylipins from fatty acids. These molecules modulate fungal growth and are possibly involved in dimorphism and virulence in Ophiostoma. The objective of this thesis was to analyze dimorphism of DED agents and verify whether this transition and pathogenesis are modulated by genes that encode dioxygenase enzymes. The effect of different stimuli on dimorphism was examined in ophiostomatoid strains that cause DED. I also verified if linoleic acid induced transition from yeast to mycelium and production of reproductive structures in these agents. In addition, I identified and characterized genes that encode dioxygenases in genomes of O. novo-ulmi H327 and O. ulmi W9. Finally, I produced a Δppo1 strain of O. novo-ulmi to determine the function of this gene. This transition is probably modulated by different mechanisms and pathways since the response to the manipulation of stimuli varied according to the strain analyzed. Salicylic acid, a cyclooxygenase inhibitor, reduced mycelial production in the strains tested. However, linoleic acid stimulated the production of mycelia and reproductive structures. No lox gene but two cox genes are present in the genomes of O. novo-ulmi H327 and O. ulmi W9. According to our results, one of these cox genes (gene ppo1 or g7173) does not seem related to the virulence or essential functions of the O. novo-ulmi life cycle. Nonetheless, the Δppo1 mutants produced less mycelia in liquid medium with arginine compared to the wild-type. As observed with these data, cyclooxygenases could be related to dimorphism of DED agents.

Afin d'assurer un contrôle des dommages causés par la maladie hollandaise de l'orme, une meilleure compréhension de l'interaction hôte-pathogène s'avère nécessaire. Plus spécifiquement, cette étude vise à approfondir les connaissances du pathogène lui-même et des facteurs de virulence utilisés par celui-ci. Deux méthodes permettent d'identifier les gènes impliqués dans la pathogénie du champignon ascomycète Ophiostoma novo-ulmi : 1) la comparaison de souches présentant des niveaux de virulence très différents ou 2) la mutagenèse aléatoire. En milieu naturel il existe très peu de variation de la virulence entre les souches d'O. novo-ulmi; en conséquence, la première alternative n'était pas envisageable. C'est pourquoi nous avons développé une méthode efficace de transformation à partir d'une souche très virulente d'O. novo-ulmi (H327) afin de produire des transformants moins virulents et d'identifier l'un des gènes associés à cette perte de virulence. L'ajout d'enzyme de restriction a permis d'augmenter le taux de transformants mais n'a pas favorisé le taux d'insertions uniques du plasmide tel que mentionné dans d'autres travaux. Des séquences d'ADN génomique proches du site d'insertion du plasmide ont ensuite été isolées à partir des transformants présentant une croissance réduite. Le deuxième volet de ces travaux consiste à développer un test qui permettrait de déterminer rapidement la virulence des transformants et d'éviter l'utilisation de plants d'orme lors du criblage initial. Nous avons démontré l'utilité de mesurer les lésions sur pommes 'Golden Delicious' pour évaluer la virulence des transformants et de souches sauvages d'O. novo-ulmi. Enfin, la dernière partie de la thèse porte spécifiquement sur un transformant moins virulent, KP78, identifié précédemment lors des tests sur pommes et sur ormes. Parmi les six gènes situés dans la région de l'insertion, deux présentent une expression réduite dans le mycélium poussant sur milieu au bois d'orme. L'analyse de ségrégation de l'insertion dans une descendance issue d'un croisement entre KP78 et une souche de type sauvage a montré qu'une mutation non marquée serait responsable des caractères qui distinguent KP78 de la souche de référence H327.

L’analyse de données de transcriptomique par le biais du séquençage d’ARN messagers (RNAseq) offre une perspective globale de la régulation de l’expression génique au cours d’un évènement biologique. Dans cette thèse, nous avons exploité cette technique dans le but de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la transition morphologique réversible levure-mycélium qui est une caractéristique souvent liée au pouvoir pathogène chez les champignons. Dans un premier temps, par le biais de comparaisons de données de transcriptomique entre sept espèces fongiques dimorphiques, nous avons observé une certaine conservation des processus biologiques associés au changement de morphologie chez des champignons issus de branches très éloignées de l’arbre phylogénétique fongique. Dans un second temps, nous nous sommes concentrée sur notre modèle d’étude principal, Ophiostoma novo-ulmi, le champignon pathogène responsable de la maladie hollandaise de l’orme. Par l’analyse comparée des gènes exprimés en phases levure et mycélienne, nous avons défini les facteurs moléculaires qui sont spécifiques à chacune des phases chez O. novo-ulmi et établi une distinction claire entre les deux phases d’un point de vue du contenu en gènes exprimés. Par la suite, nous avons affiné notre étude en nous focalisant sur l’évènement de transition levure-mycélium afin déterminer les gènes dont l’expression était modulée au cours du temps dans le processus de changement morphologique. Nous avons mis en évidence plusieurs facteurs potentiellement impliqués dans la transition, notamment des gènes liés à la cascade de phosphorylation des MAPKs, connues pour jouer un rôle clé dans le dimorphisme chez plusieurs espèces fongiques. Finalement, dans le but d’évaluer plus précisément le niveau de conservation des processus biologiques liés au dimorphisme chez des espèces non modèles éloignées, nous avons comparé la régulation de l’expression génique au niveau des gènes orthologues entre O. novo-ulmi et l’espèce basidiomycète, Pseudozyma flocculosa. Nous nous sommes concentrée sur les gènes qui étaient différentiellement exprimés entre les phases de germination et de filamentation. Dans l’ensemble, les processus associés aux gènes pour lesquels la régulation de l’expression est conservée chez les deux espèces portent sur des fonctions essentielles du développement fongique. Ainsi, cette comparaison a permis de définir ce qui semble constituer la « base minimale » génique commune nécessaire à la transition asexuée levure-mycélium chez des espèces phylogénétiquement éloignées. / Large-scale transcriptomic analyses via messenger RNA sequencing (RNAseq) give access to the information on expression regulation of all the genes present in a sample at a given time and in a given experimental condition. In this thesis, we took advantage of this technology in order to investigate the molecular mechanisms that regulate the reversible yeast-to-hypha morphological switch which is a characteristic often linked to virulence in fungal pathogens. To begin with, we compared transcriptomic data among seven dimorphic fungi and found conserved biological processes associated with the morphological switch among species from very distant branches of the fungal phylogenetic tree. Later, we focused on our model species, Ophiostoma novo-ulmi, the causal agent of Dutch elm disease. We first compared the gene expression levels in yeast and mycelium growth phases. We defined the molecular factors that are specific to each growth phase and highlighted a clear molecular distinction between the two phases in terms of expressed gene contents. We further narrowed down our analysis by focusing on the yeast-to-hypha transition in a time course experiment. We determined the set of genes for which the expression was regulated during the morphological switch, thus potentially involved in the yeast-to-hypha transition. In particular, we identified genes that could be related to the MAPK cascade, known to play a crucial role in the dimorphic switch in many fungal species. Finally, in order to address the level of conservation in the biological processes linked to dimorphism in highly divergent non-model species, we compared the gene expression regulation of the orthologous genes between O. novo-ulmi and the basidiomycete Pseudozyma flocculosa. We focused on the genes that were differentially expressed between the germination and the filamentation phases. We identified several factors for which the regulation of expression seems conserved during the switch from germinating spore to filamentous growth. Overall, these genes are associated with biological processes that play essential roles in fungal development. Hence, our comparison here highlighted core components necessary for the yeast-to-hypha transition in phylogenetically distant species.

Des éléments mobiles de type 2 ont été mis en évidence chez Ophiostoma ulmi et O. novoulmi, agents pathogènes de la maladie hollandaise de l'orme. Dans un premier temps, ces transposons à ADN, nommés OPHIOl, OPHI02 et OPHI03, ont été subséquemment caractérisés, tant au niveau structural qu'au niveau de leur répartition dans les espèces concernées. L'étude approfondie de leur séquence a permis de faire ressortir des mutations particulières de type RIP (Repeat induced point mutations) uniquement présentes chez OPHI03. Ces dernières, ont par ailleurs, permis de mettre au point une nouvelle technique de visualisation de ce type de mutations (CTS visualizatiori), applicable à l'ensemble de ces éléments mobiles. Dans un second temps, la mobilité & OPHIOl et OPHI02 a fait l'objet d'une étude détaillée. Grâce à divers stress abiotiques, nous avons démontré que ces éléments sont mobiles au sein des génomes des champignons responsables de la maladie hollandaise de l'orme. En dernier lieu, des analyses bioinformatiques ont permis de mettre en évidence des zones de sélection positive au sein de domaines précis des transposases, l'enzyme requise pour la mobilité d'OPHIOl et d'OPHI02. L'ensemble de ces résultats a permis d'accroître la connaissance des TE ainsi que d'essayer de comprendre la dynamique complexe existant entre les transposons et leurs génomes hôtes. / Type 2 mobile elements were detected in Ophiostoma ulmi and O. novo-ulmi sp., the causal agents of the Dutch elm disease. Firstly, the structure and the distribution in Ophiostoma species of these DNA transposons, named OPHIOl, OPHI02 and OPHI03, were characterized. A precise analysis of their sequence demonstrated some particular RIP mutations (Repeat induced point mutations) in the case of OPHI03. These mutations allowed us to develop a new visualization (CTS visualization) for these types of mutations, applicable to ail mobile elements. Secondly, the mobility of OPHIOl and OPHIOl was the main investigation of a detailed study. We demonstrated that abiotic stresses have a direct impact on the induction of mobility of the transposons within Ophiostoma sp. To finish our investigation, bioinformatics analyses were performed on OPHIOl and OPHIOl (considered to be active transposons) and allowed the presence of regions under positive selection inside the transposase (enzyme required for their mobility). Taken together, these results lead to a better understanding of a part of the complex dynamics that links mobile elements to their host genomes.