Un excès d’énergie lumineuse peut être délétère pour les organismesphotosynthétiques ; en effet, il en résulte la formation d’espèces réactives de l’oxygène ausein des centres réactionnels. Les cyanobactéries ont adopté divers mécanismes dephotoprotection afin de contrer ce phénomène. L’un d’eux repose sur l’activité de l’OrangeCarotenoid Protein (OCP), protéine soluble qui attache un kéto-caroténoïde (hydroxyechinenone).Subissant de fortes intensités de lumière bleu-verte, l’OCP se convertit d’uneforme inactive/orange vers sa forme active/rouge. L’OCP ainsi photoactivée possède la facultéd’interagir avec les phycobilisomes - principales antennes collectrices de lumière - induisantla dissipation de l’énergie collectée par ces gigantesques complexes sous forme de chaleur. Lapression d’excitation au niveau des centres réactionnels ainsi que la fluorescence du systèmedécroissent alors.L’OCP photoactivée se fixe au coeur des phycobilisomes qui sont majoritairementconstitués de protéines chromophorylées de la famille des allophycocyanines (APC). J’aiconstruit différentes souches mutantes de Synechocystis PCC 6803 en modifiant ousupprimant les sous-unités mineures d’APC (ApcD, ApcF et ApcE). Ces sous-unités jouent lerôle essentiel d’émetteurs terminaux des phycobilisomes, véhiculant l’énergie qu’ellesreçoivent à la Chlorophylle a. J’ai aussi démontré que le mécanisme photoprotectif associé àl’OCP chez ces mutants restait inchangé, aussi bien in vivo que in vitro. Ces résultatssuggèrent qu’aucun émetteur terminal n’est nécessairement requis pour l’attachement del’OCP aux phycobilisomes et sous-entendent que l’OCP interagit probablement avec unesous-unité majeure d’APC.Divers phycobilisomes, contenant 2, 3 ou 5 cylindres d’APC dans leur coeur, ont étéisolés à partir de cyanobactéries variées. Les OCPs de Synechocytis et d’Arthrospira ont étépurifiées à partir de souches mutantes de Synechocystis. J’ai alors mené une étude in vitro desinteractions entre ces OCPs et les phycobilisomes. Le nombre de cylindres d’APC présents ausein des phycobilisomes n’affecte en rien la diminution de fluorescence. De plus, j’ai constatéque l’OCP de Synechocystis est spécifique pour ses propres phycobilisomes alors que l’OCPd’Arthrospira interagit avec tous les phycobilisomes employés ici. Des hypothèses, fondéessur les structures disponibles, ont été formulées pour élucider ces différences.Les domaines N- et C-terminaux de l’OCP d’Arthrospira ont été dissociés parprotéolyse. Le domaine N-terminal isolé conserve le caroténoïde attaché, ayant uneconformation similaire à celle observée lorsque l’OCP est photoactivée. Ce domaine Nterminalest aussi capable d’induire une importante diminution de la fluorescence desphycobilisomes. A l’inverse, le domaine C-terminal isolé est incolore et n’a aucun effet sur lafluorescence des phycobilisomes. Ces résultats suggèrent que seul le domaine N-terminal del’OCP est impliqué dans l’interaction avec les phycobilisomes. Le domaine C-terminal quantà lui module son activité. / Too much light can be lethal for photosynthetic organisms. Under such conditionsharmful reactive oxygen species are generated at the reaction center level. Cyanobacteria havedeveloped photoprotective mechanisms to avoid this. One of them relies on the solubleOrange Carotenoid Protein (OCP) that binds a ketocarotenoid (hydroxyechinenone, hECN).Under strong blue-green illumination, OCP gets photoconverted from an orange inactive form(OCPo) to a red active one (OCPr). OCPr interacts with phycobilisomes, the majorcyanobacterial light harvesting antennae, and triggers heat dissipation of the excess lightenergy collected by these gigantic pigment-protein complexes. Consequently, excitationpressure on reaction centers and fluorescence emission decrease.OCPr binds to phycobilisome cores, containing mainly chromophorylated proteins ofthe allophycocyanin (APC) family. I constructed Synechocystis PCC 6803 mutants affected insome minor APC forms (ApcD, ApcF and ApcE). These special APCs play the role ofterminal emitters, i.e. funnel light energy to Chlorophyll a. Strong-blue green illuminationtriggered normal OCP-related fluorescence quenching in all mutant cells. The fluorescencedecrease induced by Synechocystis OCP in vitro was similar when using phycobilisomesisolated from wild-type or mutant cells. These results demonstrated that the terminal emittersare not needed for interaction with the OCP and they strongly suggested that OCPr interactswith one of the major APC forms of the phycobilisome core.Phycobilisomes containing 2, 3 or 5 APC cylinders per core were isolated fromdifferent cyanobacterial strains. Synechocystis and Arthrospira OCPs were purified from overexpressingSynechocystis mutant strains. I then performed in vitro OCP/phycobilisomeinteraction studies. The number of APC cylinders per core had no clear influence on theamount of fluorescence quenching. Both OCPs behaved very differently, one appearing muchmore species-specific than the other. Structure-based hypotheses were emitted to explain suchdissimilarity.Arthrospira OCP N-terminal and C-terminal domains were separated throughproteolysis. The isolated N-terminal domain retained a bound carotenoid, which displayedsimilar conformation than in OCPr. This isolated N-terminal domain triggered importantphycobilisome fluorescence quenching even under dark conditions. In contrast, the isolated Cterminaldomain attached no pigment and had no visible effect on phycobilisome emission. Itwas then proposed that only the N-terminal domain of OCP is implied in interactions withphycobilisomes. The C-terminal domain modulates its activity.

Les cyanobactéries sont des organismes procaryotes photosynthétiques. Si l’énergie leur est essentielle, elle peut également être délétère. Afin de se protéger, elles ont acquis plusieurs mécanismes de photoprotection. La thématique de ma thèse est l’étude de l’un d’entre eux par des approches combinées de biologie moléculaire, biochimie et biophysique.Les antennes collectrices de lumière des cyanobactéries sont des complexes extra-membranaires solubles appelés les phycobilisomes. Ils permettent de canaliser l'énergie vers les centres réactionnels des photosystèmes. Sous forte lumière, l'afflux d’énergie y parvenant crée notamment des espèces réactives de l’oxygène, ce qui est délétère pour la cellule. L’Orange Carotenoid Protein (OCP) est impliquée dans un mécanisme de photoprotection qui diminue l'énergie arrivant au niveau des centres réactionnels en augmentant la part d’énergie dissipée sous forme de chaleur. L’OCP est une caroténo-protéine composée de deux domaines globulaires N- et C-terminal qui lie un caroténoïde. Cette protéine photoactivable est à la fois le senseur, et l’acteur du mécanisme de photoprotection. Le mécanisme est désactivé par une seconde protéine, la FRP (Fluorescence Recovery Protein).Le premier chapitre de ce travail de thèse rapporte l’étude de la spécificité des OCPs isolées chez deux souches différentes pour différentes classes de phycobilisomes dont l’architecture du cœur diffère. Le second chapitre présente la méthode mise au point au laboratoire de production de l’OCP chez E.coli, ainsi que la caractérisation d’OCPs clonées depuis le génome de Synechocystis, A. variabilis et A. platensis et surexprimés chez E. coli. Le troisième présente la structure tridimensionnelle du domaine N-terminal, qui est le domaine effecteur de l’OCP. Dans ce chapitre, nous démontrons que le cofacteur caroténoïde se déplace de 12 angstrom au sein de l’OCP lors de la photoactivation. Le quatrième rapporte que le bras N-terminal de l’OCP est une structure singulière qui maintient la protéine fermée à l’obscurité, évitant que l’OCP ne s’active sous faible lumière, ou à l’obscurité. Le cinquième présente la résolution de la structure et l’identification du site actif de la FRP qui nous ont permis de prédire in silico le site d’attachement putatif de la FRP sur le domaine C-terminal de l’OCP. Dans le chapitre 6, je rapporte que deux résidus, l’aspartate 220 et la phénylalanine 299, sont requis pour que l’activité de la FRP soit maximale, confirmant le site d’interaction prédit. / Cyanobacteria, a photosynthetic prokaryote organism, harvest light for living. But harvesting too much light can be harmful. To protect themselves against this stress, cyanobacteria have developed several photoprotective mechanisms. This manuscript reports my work about one of them by combined technics of molecular biology, biochemistry and biophysics.Cyanobacterial light harvesting antennae are extra-membranous complexes called phycobilisomes. They funnel harvested energy into the photosynthetic reaction centers. Under high light, high energy input induces the formation of reactive oxygen species (ROS), which are harmful in excess. One of the existent photoprotective mechanisms helps to avoid ROS formation by decreasing the energy arriving at the reaction centers. The main actor of this mechanism is the photoactive Orange Carotenoid Protein (OCP) that binds to the phycobilisome, and induces an increase of the part of energy dissipated as heat. The OCP is a protein composed by two globular domains (called N- and C- terminal) and binds a carotenoid cofactor. High intensity of blue-green light triggers conformational changes in the inactive orange OCP, which turns red and is now able to binds the PBs. Under low light conditions, this mechanism is turned off by another protein, the Fluorescence Recovery Protein (FRP).The first chapter of this manuscript reports the study of the specificity of OCPs isolated from two strains for different classes of phycobilisomes with different core architecture. The second describe the development of a method to produce holoOCP in E. coli cells. Furthermore, it reports the characterization of the Synechocystis, A. variabilis and A. platensis OCPs isolated from E. coli. The third chapter presents the tridimensional structure of the active N-terminal domain of the OCP. In this chapter, we demonstrate that the carotenoid undergoes a 12anstrom movement upon photoactivation. The fourth chapter rapports that the N-terminal arm of the OCP helps to maintain closed the inactive orange OCP in darkness or low light, avoiding OCP activation and consequent unwanted PBs fluorescence quenching. The fifth presents the resolution of the structure and the identification of the active site of the FRP. These data allow to compute a predictionnal model of interaction between OCP and FRP. I assessed the validity of the model by isolating several modified OCPs. Results shown in chapter 6 report that the aspartate 220 end the phenylalanine 299 are required for effective FRP action.

La lumière est essentielle pour les organismes photosynthétiques qui convertissent l'énergie solaire en énergie chimique. Cependant, la lumière devient dangereuse lorsque l'énergie qui arrive aux centres réactionnels de l'appareil photosynthétique, est en excès par rapport à l’énergie consommée. Dans ce cas, la chaîne de transport d'électrons photosynthétiques se réduit et les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont accumulées, notamment au niveau des deux photosystèmes, PSI et PSII. Les cyanobactéries ont développé des mécanismes photoprotecteurs qui diminuent l'énergie transférée au PSII atténuant ainsi l'accumulation de ROS et les dommages cellulaires, comme l’extinction non-photochimique (NPQcya) induite par la lumière bleue-verte. La soluble Orange Caroténoïde Protéine (OCPo) est essentielle pour ce mécanisme de photoprotection. L'OCP agit comme un senseur de l’intensité lumineuse et un inducteur de la dissipation d'énergie des phycobilisomes (PBS), l'antenne extra-membranaire des cyanobactéries. L'OCP est la première protéine photo-active à caroténoïde connue comme senseur. Une forte lumière bleue-verte déclenche des changements structurels dans l'OCPo qui induisent une forme active, rouge (OCPr). Le domaine N-terminal de l’OCPr, en s’intercalant entre les trimères externes d’un des cylindres basaux du cœur du PBS, augmente la dissipation thermique de l'énergie au niveau de l'antenne. L'OCP possède aussi une autre fonction : l’extinction de l’oxygène singulet, qui protège les cellules du stress oxydatif. Pour récupérer pleinement la capacité de l’antenne en faible lumière, une deuxième protéine est nécessaire, la "Fluorescence Recovery Protein" (FRP), dont le rôle est de détacher l’OCPr des PBS et d’accélérer sa reconversion en OCPo inactive. Ce manuscrit est un état des lieux des connaissances et des dernières avancées sur le mécanisme de NPQ associé à l'OCP dans les cyanobactéries. / Photosynthetic organisms use light energy from the sun in order to perform photosynthesis and to convert solar energy into chemical energy. Absorbance of excess light energy beyond what can be consumed in photosynthesis is dangerous for these organisms. Reactive oxygen species (ROS) are formed at the reaction centers and collecting light antennas inducing photooxidative damage which can lead to cell death. In cyanobacteria, one of these photoprotective mechanisms consists to reduce the amount of energy arriving to the reaction centers by thermal dissipation of the excess absorbed energy. Energy dissipation is accompanied by a decrease of Photosystem II-related fluorescence emission called non-photochemical quenching (NPQ). The soluble Orange Carotenoid Protein (OCPo) is essential for this photoprotective mechanism. The OCP is the first photo-active protein with a carotenoid known as light intensity sensor and acts as energy quencher of the phycobilisome (PB), the extra-membrane antenna of cyanobacteria. Structural changes occur when the OCPo absorbs a strong blue-green light leading to a red active form (OCPr). The N-terminal domain of OCPr burrows into the two external trimers of the core basal APC cylinders of the PB and increases thermal energy dissipation at the level of antenna. The OCP has an additional function in photoprotection as oxygen singlet quencher protecting cells from oxidative stress. Under low light conditions, to recover the full antenna capacity, a second protein is needed, the "Fluorescence Recovery Protein" (FRP), whose role is to detach the OCPr from the PB and accelerate its conversion into an inactive OCPo. In this manuscript, I will review the knowledge about the OCP, since the discovery of the mechanism and its characterization to the latest advances on the OCP-related-NPQ mechanism in cyanobacteria.

Too much light can be lethal for photosynthetic organisms. Under such conditionsharmful reactive oxygen species are generated at the reaction center level. Cyanobacteria havedeveloped photoprotective mechanisms to avoid this. One of them relies on the solubleOrange Carotenoid Protein (OCP) that binds a ketocarotenoid (hydroxyechinenone, hECN).Under strong blue-green illumination, OCP gets photoconverted from an orange inactive form(OCPo) to a red active one (OCPr). OCPr interacts with phycobilisomes, the majorcyanobacterial light harvesting antennae, and triggers heat dissipation of the excess lightenergy collected by these gigantic pigment-protein complexes. Consequently, excitationpressure on reaction centers and fluorescence emission decrease.OCPr binds to phycobilisome cores, containing mainly chromophorylated proteins ofthe allophycocyanin (APC) family. I constructed Synechocystis PCC 6803 mutants affected insome minor APC forms (ApcD, ApcF and ApcE). These special APCs play the role ofterminal emitters, i.e. funnel light energy to Chlorophyll a. Strong-blue green illuminationtriggered normal OCP-related fluorescence quenching in all mutant cells. The fluorescencedecrease induced by Synechocystis OCP in vitro was similar when using phycobilisomesisolated from wild-type or mutant cells. These results demonstrated that the terminal emittersare not needed for interaction with the OCP and they strongly suggested that OCPr interactswith one of the major APC forms of the phycobilisome core.Phycobilisomes containing 2, 3 or 5 APC cylinders per core were isolated fromdifferent cyanobacterial strains. Synechocystis and Arthrospira OCPs were purified from overexpressingSynechocystis mutant strains. I then performed in vitro OCP/phycobilisomeinteraction studies. The number of APC cylinders per core had no clear influence on theamount of fluorescence quenching. Both OCPs behaved very differently, one appearing muchmore species-specific than the other. Structure-based hypotheses were emitted to explain suchdissimilarity.Arthrospira OCP N-terminal and C-terminal domains were separated throughproteolysis. The isolated N-terminal domain retained a bound carotenoid, which displayedsimilar conformation than in OCPr. This isolated N-terminal domain triggered importantphycobilisome fluorescence quenching even under dark conditions. In contrast, the isolated Cterminaldomain attached no pigment and had no visible effect on phycobilisome emission. Itwas then proposed that only the N-terminal domain of OCP is implied in interactions withphycobilisomes. The C-terminal domain modulates its activity.

De fortes illuminations peuvent être dommageables voire même létales pour les organismes photosynthétiques. Une des stratégies utilisées pour se protéger de tels effets délétères consiste à augmenter la dissipation thermique de l’énergie absorbée en excès au niveau des antennes. Chez les cyanobactéries une protéine photo-active, l’Orange Carotenoid Protein (OCP), contrôle ce processus. Une fois photo-activée l’OCP interagit avec le coeur des phycobilisomes (PBs, les antennes collectrices majoritaires chez les cyanobactéries) et déclenche le mécanisme, entrainant à la fois une baisse de l’énergie parvenant aux photosystèmes et une diminution de la fluorescence des PBs. L’énergie absorbée en excès est dissipée sous forme de chaleur. Pour que les PBs regagnent leur pleine capacité de transfert, une autre protéine nommée Fluorescence Recovery Protein (FRP) est requise. La FRP accélère la désactivation de l’OCP. Dans ce manuscrit, je vais présenter ma contribution à la compréhension du mécanisme de photo-protection lié à l’OCP.J’ai continué la caractérisation de la FRP chez Synechocystis PCC 6803, organisme modèle utilisé dans nos études. J’ai montré que la FRP de Synechocystis est plus courte que ce qui est indiqué dans Cyanobase, commençant en fait à la méthionine 26. Mes résultats ont aussi révélé que la photo-protection n’a lieu que lorsque le ratio OCP/FRP est élevé.Le plus grand aboutissement de ma thèse a été la reconstitution in vitro du mécanisme de photo-protection lié à l’OCP en utilisant de l’OCP, de la FRP et des PBs isolés. J’ai montré que la lumière est requise uniquement pour la photo-activation de l’OCP et que l’attachement de l’OCP au PB ne demande aucune illumination. Ce n’est qu’une fois photo-activée que l’OCP peut interagir avec le PB et entrainer la diminution de fluorescence (quenching). En se basant sur les résultats obtenus in vitro nous avons proposé un modèle moléculaire pour le mécanisme de photo-protection lié à l’OCP. Le système de reconstitution in vitro a été utilisé pour évaluer l’importance d’un pont salin conservé (Arg155-Glu244) entre les deux domaines de l’OCP et a révélé que celui-ci stabilise la forme inactive de l’OCP. La photo-activation entraine rupture du pont salin, l’Arg155 étant ensuite impliquée dans l’interaction entre OCP et PB. Le site d’attachement de l’OCP au coeur du PB a aussi été étudié en utilisant le système in vitro. Nos résultats ont montré que les émetteurs terminaux du PB ne sont pas requis et que le site primaire de quenching est un trimère d’allophycocyanine émettant à 660nm. Enfin nous avons étudié les propriétés des états excités du caroténoïde dans l’OCP photo-activée, montrant qu’un de ces états a un caractère de transfert de charge très prononcé et peut avoir un rôle principal dans la dissipation de l’énergie. Nos résultats suggèrent fortement que non seulement l’OCP induit dissipation de l’énergie absorbée sous forme de chaleur mais aussi que l’OCP agit directement comme dissipateur d’énergie. / Strong light can cause damage and be lethal for photosynthetic organisms. An increase of thermal dissipation of excess absorbed energy at the level of photosynthetic antenna is one of the processes protecting against deleterious effects of light. In cyanobacteria, a soluble photoactive carotenoid binding protein, Orange Carotenoid Protein (OCP) mediates this process. The photoactivated OCP by interacting with the core of phycobilisome (PB; the major photosynthetic antenna of cyanobacteria) triggers the photoprotective mechanism, which decreases the energy arriving at the reaction centres and PSII fluorescence. The excess energy is dissipated as harmless heat. To regain full PB capacity in low light intensities, theFluorescence Recovery Protein (FRP) is required. FRP accelerates the deactivation of OCP.In this work, I present my input in the understanding of the mechanism underlying the OCPrelated photoprotection. I further characterized the FRP of Synechocystis PCC6803, the model organism in our studies. I established that the Synechocystis FRP is shorter than what it was proposed in Cyanobase and it begins at Met26. Our results also revealed the great importance of a high OCP to FRP ratio for existence of photoprotection. The most remarkable achievement of this thesis is the in vitro reconstitution of the OCPrelated mechanism using isolated OCP, PB and FRP. I demonstrated that light is only needed for OCP photoactivation but OCP binding to PB is light independent. Only the photoactivated OCP is able to bind the PB and quench all its fluorescence. Based on our in vitro experiments we proposed a molecular model of OCP-related photoprotection. The in vitro reconstituted system was applied to examine the importance of a conserved salt bridge (Arg155-Glu244) between the two domains of OCP and showed that this salt bridge stabilises the inactive form of OCP. During photoactivation this salt bridge is broken and Arg155 is involved in the interaction between the OCP and the PB. The site of OCP binding in the core of a PB wasalso investigated with the in vitro reconstituted system. Our results demonstrated that the terminal energy emitters of the PB are not needed and that the first site of fluorescence quenching is an APC trimer emitting at 660 nm. Finally, we characterised the properties of excited states of the carotenoid in the photoactivated OCP showing that one of these states presents a very pronounced charge transfer character that likely has a principal role in energy dissipation. Our results strongly suggested that the OCP not only induces thermal energy dissipation but also acts as the energy dissipator.

Strong light can cause damage and be lethal for photosynthetic organisms. An increase of thermal dissipation of excess absorbed energy at the level of photosynthetic antenna is one of the processes protecting against deleterious effects of light. In cyanobacteria, a soluble photoactive carotenoid binding protein, Orange Carotenoid Protein (OCP) mediates this process. The photoactivated OCP by interacting with the core of phycobilisome (PB; the major photosynthetic antenna of cyanobacteria) triggers the photoprotective mechanism, which decreases the energy arriving at the reaction centres and PSII fluorescence. The excess energy is dissipated as harmless heat. To regain full PB capacity in low light intensities, theFluorescence Recovery Protein (FRP) is required. FRP accelerates the deactivation of OCP.In this work, I present my input in the understanding of the mechanism underlying the OCPrelated photoprotection. I further characterized the FRP of Synechocystis PCC6803, the model organism in our studies. I established that the Synechocystis FRP is shorter than what it was proposed in Cyanobase and it begins at Met26. Our results also revealed the great importance of a high OCP to FRP ratio for existence of photoprotection. The most remarkable achievement of this thesis is the in vitro reconstitution of the OCPrelated mechanism using isolated OCP, PB and FRP. I demonstrated that light is only needed for OCP photoactivation but OCP binding to PB is light independent. Only the photoactivated OCP is able to bind the PB and quench all its fluorescence. Based on our in vitro experiments we proposed a molecular model of OCP-related photoprotection. The in vitro reconstituted system was applied to examine the importance of a conserved salt bridge (Arg155-Glu244) between the two domains of OCP and showed that this salt bridge stabilises the inactive form of OCP. During photoactivation this salt bridge is broken and Arg155 is involved in the interaction between the OCP and the PB. The site of OCP binding in the core of a PB wasalso investigated with the in vitro reconstituted system. Our results demonstrated that the terminal energy emitters of the PB are not needed and that the first site of fluorescence quenching is an APC trimer emitting at 660 nm. Finally, we characterised the properties of excited states of the carotenoid in the photoactivated OCP showing that one of these states presents a very pronounced charge transfer character that likely has a principal role in energy dissipation. Our results strongly suggested that the OCP not only induces thermal energy dissipation but also acts as the energy dissipator.