L’analyse protéomique consiste en l’analyse qualitative et quantitative de l’ensemble des protéines exprimées dans une cellule ou tissu dans des conditions données (protéome). Les progrès instrumentaux en spectrométrie de masse et les avancées bioinformatiques des dernières années ont permis d’imposer ce domaine dans les sciences de la vie. Diverses stratégies protéomiques permettent ainsi, aujourd’hui, d’identifier et quantifier plusieurs centaines/milliers de protéines dans un échantillon complexe, ce qui permet classiquement de caractériser les états physiopathologiques. En revanche, la protéomique est un outil émergent en biologie évolutive. Ce domaine vise à comprendre les déterminants de la diversité des organismes présents sur Terre et de leur « fonctionnement », notamment leurs adaptations à certaines contraintes environnementales.L’objectif de cette thèse était d’étudier, de l’organe à l’écosystème, les variations protéomiques induites par des changements environnementaux, tout en adaptant les différentes étapes de l’analyse à chaque type d’échantillons, à chaque organisme, de la préparation d’échantillons à l’analyse des données. Grâce à la mise en place d’une stratégie de séquençage de novo quantitative originale, ces travaux de thèse ont été l’occasion d’étudier le rôle du tissu adipeux brun dans la protection contre l’obésité chez le campagnol, espèce dont le génome n’est pas séquencé. D’autres traits particuliers ont été explorés, tels que l’obésité réversible du microcèbe, ou encore les interactions entre socialité et longévité chez la fourmi. Les solutions logicielles envisagées ne permettant de quantifier de manière robuste des peptides identifiés par séquençage de novo à partir d’échantillons fractionnés, nous avons ainsi établi que le préfractionnement permet d’obtenir une meilleure couverture de protéome. En revanche, sans préfractionnement, le séquençage de novo produit un gain indéniable. Enfin, en étudiant le métaprotéome de communautés biotiques des sols alpins, nous avons mis en évidence l’intérêt de combiner protéomique et génomique, afin d’établir la banque de données protéiques la plus appropriée, mais aussi pour « valider » les données protéomiques. / Proteomics analysis corresponds to the qualitative and quantitative analysis of all proteins expressed in a cell or tissue under given conditions (proteome). Instrumental progresses in mass spectrometry and bioinformatics advances in recent years have allowed its establishment in life sciences. Diverse proteomics strategies thus allow identification and quantification of hundreds/thousands of proteins in complex samples, which classically allows physiopathological states to be characterized. However, proteomics is only emerging in the evolutionary biology field. This field aims at understanding the determinants of the diversity of organisms present on Earth and their “functioning”, including their adaptations to certain environmental constraints.The objective of this thesis was to study, from the organ to the eco-system, the proteomic variations induced by environmental changes, while adapting the different steps of the analysis to each type of sample, each organism, from sample preparation to data analysis. Through the introduction of an original quantitative de novo sequencing strategy, we studied the role of brown adipose tissue against obesity in a non-sequenced species: the vole. Other particular traits were explored, such as the reversible obesity of the grey mouse lemur or the interactions between sociality and longevity in the ant. The considered software solutions did not allow to robustly quantify peptides identified by de novo sequencing from fractionated samples, we thus determined that prefractionation allows for better proteome coverage. On the other hand, without prefractionation, de novo sequencing produces an undeniable gain. Finally, by studying the metaproteome of alpine soil biotic communities, we have highlighted the advantage of combining proteomics and genomics, in order to establish the most appropriate protein database and to “validate” proteomics data.