Les avancées en biologie moléculaire et cellulaire des dernières décennies ont permis de redéfinir le rôle de l’ARN au sein des cellules de tous les domaines du vivant. Initialement cantonné dans un rôle de support transitoire de l’information génétique du génome (ADN) en direction des effecteurs ou molécules actives (protéines et métabolites), l’ARN est maintenant associé à toutes les sphères de la biologie. Les molécules d’ARN peuvent agir autant comme génome (virus), comme molécules adaptatrices (ARNt), comme messager de l’information génétique (ARNm), comme enzyme (ribozyme) ou encore comme molécules régulatrices en cis (riboswitch) ou en trans (miARN). Nous savons aussi que la grande majorité du génome des cellules eucaryotes est transcrite à un moment ou un autre. Ces implications de l’ARN en font une cible de choix pour la recherche en génomique fonctionnelle, ainsi que pour des applications thérapeutiques. C’est pourquoi, depuis la découverte des ARN catalytiques et de l’interférence à l’ARN, beaucoup d’efforts ont été consacrés pour développer un éventail d’outils moléculaires permettant d’inhiber l’expression de gènes d’intérêt. Le défi qui se dessine aujourd’hui est le développement d’outils plus spécifiques et plus efficaces, entre autres parce que la variété d’ARN qu’un inhibiteur peut rencontrer est beaucoup plus grande qu’initialement estimée. De plus, les données recueillies lors d’essais cliniques montrent la nécessité de combiner un très grand potentiel avec une spécificité accrue. Les travaux de cette thèse se concentrent sur un outil moléculaire qui a le potentiel de répondre positivement à ce défi : le ribozyme SOFA-HDV. Mon projet de recherche visait à démontrer le potentiel de cet ARN catalytique pour le ciblage de gènes in cellulo et de développer son application. Tout d’abord, j’ai démontré que le ribozyme SOFA-HDV pouvait être utilisé pour inhiber la fonction d’un ARN in cellulo. Cette étude a également mis en évidence l’usage de ce ribozyme comme agent antiviral, avec le virus de l’hépatite C comme modèle. Le développement de nouvelles thérapies plus performantes avec peu d’effets secondaires demeure un enjeu important. Au moment de publier ces travaux, en plus d’être le premier exemple exhaustif de l’utilisation du ribozyme SOFA-HDV in cellulo, notre étude contenait le plus grand nombre de ribozymes jamais testés contre le VHC en une seule publication. Bien que modeste, l’effet observé démontre que ce ribozyme peut inhiber la réplication d’un virus dans un modèle in cellulo. Nos résultats exposent aussi la différence d’accessibilité entre les ARN de polarités positive et négative du VHC in cellulo. Par la suite, j’ai participé au développement de ribozymes SOFA-HDV ciblant le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) dans le cadre d’une collaboration. Parmi les ribozymes testés, nous en avons identifié un dont l’activité catalytique réduit la réplication du VIH de plus de 50 % dans un modèle cellulaire. Dans le cadre de cette étude, nous avons identifié un site hautement favorable pour le ciblage par un ribozyme SOFA-HDV ou par un shARN. Des données suggèrent aussi une spécificité élevée du ribozyme SOFA-HDV. Des tests d’inhibition avec différentes souches du VIH montrent que l’activité du ribozyme est affectée avec un seul mésappariement entre le biosenseur (élément du module SOFA resposable de reconnaissance du substrat) et son site de liaison. Finalement, dans un esprit d’intégration des connaissances recueillies au fil des différents projets impliquant le ribozyme SOFA-HDV, je me suis intéressé à leur processus de sélection pour le ciblage génique. J’ai démontré l’impact de la séquence du biosenseur sur l’activité du ribozyme. J’ai également illustré l’autocoupure possible lorsque la séquence du biosenseur crée un prolongement du bloqueur (élément du module SOFA agissant comme verrou) ainsi que l’impact de la structure du substrat autant au niveau des sites de liaison du domaine de reconnaissance que du biosenseur. Ces nouveaux éléments combinés aux données antérieures sur le ribozyme HDV original m’ont permis d’élaborer une marche à suivre pour la présélection des ribozymes SOFA-HDV selon leur potentiel comme ciseaux moléculaires. En conclusion, ces travaux ont contribué à mettre de l’avant le potentiel du ribozyme SOFA-HDV pour des applications de ciblage de gènes, plus particulièrement pour des cibles virales. De ce fait, il existe maintenant des exemples concrets de l’utilisation de ce ribozyme en cellules humaines. Tout indique que la spécificité du module SOFA est préservée in cellulo et serait avantageusement comparable à d’autres technologies. Globalement, cette thèse devrait rendre l’utilisation du ribozyme SOFA-HDV plus accessible et favoriser son développement comme outil moléculaire.

La fusariose vasculaire du cyclamen est une maladie causée par le champignon tellurique Fusarium oxysporum f. sp. cyclaminis. Elle est considérée comme l’une des maladies les plus graves du cyclamen et se traduit par des pertes atteignant jusqu’à 50 % de la production. Actuellement, les moyens de lutte ne permettent pas de contrôler la maladie. Dans ce contexte, une collaboration s’est engagée entre l’institut technique de l’horticulture, Astredhor, représentant les producteurs, l’INRA de Dijon pour son expertise sur F. oxysporum et la société Agrene pour son expertise en lutte biologique. Les objectifs de cette collaboration étaient doubles : i) identifier un marqueur spécifique de la forme spéciale cyclaminis et développer un outil de détection de l’agent pathogène permettant de mettre en place des méthodes de lutte appropriées ; ii) identifier un agent de lutte biologique efficace contre le pathogène. Le travail s’est donc structuré autour de ces deux objectifs.Une collection de souches représentatives de la diversité des populations de F. oxysporum f. sp. cyclaminis a été constituée. Elle regroupe des souches provenant de collections internationales et des isolats obtenus de cyclamens symptomatiques ou non. L’analyse moléculaire de cette collection a permis de caractériser son importante diversité génétique et a mis en exergue la difficulté d’identifier un marqueur moléculaire spécifique. Néanmoins, un fragment d’ADN spécifique de l’agent pathogène a pu être mis en évidence par amplification aléatoire d’ADN polymorphe. A partir de ce fragment, un couple d’amorces spécifiques a été dessiné et un outil moléculaire a été développé. Ce dernier permet une détection du champignon in planta en PCR conventionnelle et en PCR en temps réel.Parallèlement, une étude bibliographique approfondie relative aux méthodes de lutte biologique contre les fusarioses induites par F. oxysporum sur les plantes ornementales a été effectuée. Cette revue a souligné la possibilité d’utiliser des ressources d’origine microbienne et d’origine végétale pour contrôler F. oxysporum, mais cette stratégie impliquant une étape de sélection nous est apparue lourde et laborieuse. Nous avons opté pour une autre démarche visant à identifier, parmi des produits déjà sur le marché, ceux susceptibles de réduire significativement la gravité de la maladie. Des bioessais ont été conduits en serre, dans des conditions proches de celles de la production pour tester sept produits reposant sur la formulation de bactéries, de champignons ou de combinaisons de ces microorganismes. Les produits les moins performants ont été éliminés à l’issue d’un premier essai. Des bioessais ont été conduits à nouveau avec trois produits. Un seul de ces produits donne satisfaction mais son efficacité devra être validée en conditions de production réelles.En conclusion, l’outil de détection spécifique permettra aux producteurs de s’assurer de la qualité sanitaire de la culture et des supports de culture. L’agent de lutte biologique retenu à l’issue de nos essais permettra dans un premier temps aux producteurs de prévenir le risque d’activité infectieuse de F. oxysporum f. sp. cyclaminis. Cependant, un travail de recherche d’un agent de lutte plus performant s’avère nécessaire. Des pistes sont proposées. / Fusarium wilt of cyclamen is one of the most damaging diseases of cyclamen. The causal agent, Fusarium oxysporum f. sp. cyclaminis, is a soil-borne fungus. Losses can reach more than 50 % of the production. Several methods of control are available, but none of them offer an efficient and environmentally friendly solution. In this context, a project was developed in collaboration with the French institute of horticulture, Astredhor, which represents the producers, the INRA of Dijon, for its expertise on F. oxysporum and the company Agrene for its expertise in biological control. The project has two goals: i) design a molecular marker specific of Fusarium oxysporum f. sp. cyclaminis allowing a better management of the disease, ii) identify one or several efficient biological control agents.A collection of strains representative of the diversity of F. oxysporum f. sp. cyclaminis populations was made up with strains from international collections and isolates collected from symptomatic and asymptomatic cyclamens. A molecular study of the collection demonstrated the high genetic diversity of the forma specialis, which makes the identification of a specific molecular marker more complicated. However, a specific DNA fragment was identified by random amplified polymorphic DNA. A primer pairs was designed and a specific tool of detection was developed. Thanks to this tool, it is now possible to detect the fungus in planta by conventional and real-time PCR.Simultaneously, a broad literature analysis on the biocontrol of ornamental plant diseases caused by F. oxysporum was performed. The review emphasized that biocontrol of F. oxysporum encompassed both microbial biocontrol agents and botanicals. To avoid the laborious and time-consuming screening step, we decided to assess the antagonistic activity of seven commercial products containing bacteria, fungi or a combination of both microorganisms. Greenhouse trials were performed under conditions similar to those of the production. First trial led to the exclusion of the less efficient products. Other trials were conducted with the three remaining products. Disease reduction was obtained with one of these products although it must be validated in production.Finally, the molecular tool of detection will allow producers to insure the health status of the culture. In addition, the efficient biocontrol agent identified will prevent the disease progress for a while but more investigations are needed to obtain reliable, efficient and sustainable biocontrol agents. Proposals to improve Fusarium wilt control are discussed.