Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-10T20:41:16Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Lidiane Vasconcelos do Nascimento Carvalho.pdf: 2054421 bytes, checksum: b5dd34d7bb0e55942b8e39b404d70b3c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T20:41:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Lidiane Vasconcelos do Nascimento Carvalho.pdf: 2054421 bytes, checksum: b5dd34d7bb0e55942b8e39b404d70b3c (MD5) Previous issue date: 2016-08-12 / FACEPE / O câncer é uma doença que representa um grave problema de saúde pública em todas as nações do mundo, sua incidência tem aumentado devido à crescente exposição da população a fatores de risco e ao aumento da expectativa de vida. A quimioterapia é a modalidade de tratamento mais empregada, pois possui a vantagem de atuar de forma sistêmica. No entanto, sabe-se que a grande maioria dos agentes quimioterápicos não age exclusivamente em células tumorais, podendo levar a diferentes graus de toxicidade em células normais. Ademais, células neoplásicas adquirem a capacidade de se tornarem resistentes a vários quimioterápicos diminuindo a eficácia do tratamento, a qualidade de vida e a perspectiva de cura dos pacientes. Nesse sentido, a presente proposta teve como finalidade a elucidação do mecanismo de ação de um novo agente antineoplásico por meio da análise proteômica na linhagem leucêmica resistente, HL60/MX1. As oxazolidinas e seus derivados já possuem diversas atividades descritas na literatura entre elas potencial ação antineoplásica. No estudo foi utilizado o derivado oxazolidinico LPSF-NB-3 que em um estudo anterior do grupo apresentou ação na referida linhagem. Inicialmente buscou-se confirmar a toxicidade do novo derivado em células saudáveis e na linhagem resistente. LPSF-NB-3 não foi tóxico em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) na maior dose testada (100 μM) e apresentou valor de IC₅₀ de 56,33 μM na linhagem HL60/MX1. Diante dos resultados, foi realizada cultura celular para elucidação do mecanismo de ação pela análise proteômica. Após 48 horas de tratamento, foi realizada a extração de proteínas com tampão de lise celular e inibidor de proteases e a amostra foi submetida à abordagem proteômica gel free e label free utilizando cromatografia bidimensional acoplada à espectrometria de massas (nanoUPLC). Após o processamento dos dados brutos utilizando o programa Protein Lynks Global Sever, foi possível identificar um total de 2.650 proteínas. Em nossa análise somente foram consideradas as proteínas identificadas em todas as replicatas experimentais, bem como as que apresentaram modulação de mais que duas vezes. Com isso, após utilizarmos este filtro, 634 proteínas, de fato, foram analisadas com a ferramenta Expression ᴱ. Dentro do universo de proteínas consideradas para a análise quantitativa com os critérios estabelecidos, 262 estavam diferencialmente expressas, sendo 146 com expressão aumentada e 116 com expressão diminuída na amostra tratada com o derivado quando comparadas com o controle. As proteínas identificadas foram analisadas no programa MetaCore™ para que as principais funções e vias de sinalização alteradas pudessem ser identificadas. Dentre os principais processos biológicos diferencialmente expressos, destacam-se processos envolvendo regulação do citoesqueleto, dano ao DNA, transdução de sinais celulares e processos envolvendo crescimento celular e sua manutenção. Duas vias moduladas receberam destaque em nossa análise, são elas: a via de sinalização AKT e vias do sistema imune. Essa última pôde ser validada pela técnica de ELISA que evidenciou a capacidade do derivado em diminuir a expressão de IFN- γ de forma significativa (p <0.01) nas doses de 50 e 100 μM e de outras citocinas inflamatórias importantes no contexto tumoral, indicando assim seu provável mecanismo de ação. / Cancer represents a serious public health problem in every nation of the world. Its incidence has increased due growing population exposure to risk factors and life expectancy. Chemotherapy is more used as treatment because it acts systemically. However, it is known that most chemotherapeutic agents don‘t kill only tumor cells, leading to different degrees of normal cells toxicity. In addition, neoplastic cells can become resistant to chemotherapy reducing treatment success, quality of life and chance of cure. Therefore, this proposal aimed to elucidate the mechanism of action of a new antineoplastic agent in resistant leukemic strain (HL60 / MX1) by proteomic analysis. Oxazolidines and their derivatives have several activities described on literature including antineoplastic potential. LPSF-NB-3 is an oxazolidine derivative that presented antineoplastic activity on HL-60 / MX1 cells in an earlier study. Initially we aimed to confirm toxicity in healthy cells and in this resistant strain. LPSF-NB-3 was non-toxic in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) at the highest tested dose (100 μM) and presented IC50 value of 56.33 μM in HL60 / MX1 strain. Cell culture was performed to elucidate the mechanism of action by proteomic analysis. After 48 hours of treatment, a protein extraction with cellular lysis buffer and protease inhibitor was performed and sample was applied to proteomic approach gel free and label free using two-dimensional chromatography coupled to mass spectrometry (nanoUPLC). Protein Lynks Global Sever program processed data and identified 2,650 proteins. In this analysis were only considered proteins identified in all experimental replicates, such as those modulated more than two times. After using this filter, 634 proteins were analyzed by Expression E tool. Within the universe of proteins considered by quantitative analysis with the established criteria, 262 were differentially expressed, being 146 increased and 116 decreased in the sample treated with the derivative when compared to control. The identified proteins were analyzed by MetaCore™ to identify changes in main functions and signaling pathways. Among the biological processes differentially expressed are those involving cytoskeletal regulation, DNA damage, cell signal transduction and cell growth and its maintenance. Two modulated pathways were highlighted in our analysis: an AKT signaling pathway and immune system pathways. The last one was validated by ELISA showing derivative capacity to reduce important inflammatory cytokines in tumor context IFN-g decreasing was statistically significant (P <0.01) at 50 and 100 μM doses] indicating its probable mechanism of action.

Quando o tetrafluoroborato de N-(&#945;-carbometoximetil)-2,4,6-trifenilpiridínio (Ia) foi tratado com hidróxido de potássio em etanol, resultou uma betaína que, ao ser aquecida na presença de benzaldeído ou p-clorobenzaldeído, não produziu a esperada oxazolidina IIa. Em lugar desta 1,2-di-hidropiridina, formou-se um sal cujo cátion correspondia à estrutura de um N-metil-2,4,6-trifenilpiridínio (III). Este composto resultaria da protonação da ilida intermediária, formada pela descarboxilação da betaína. Porém, quando o mesmo tipo de reação foi efetuada com o derivado &#945;-metilado Ib, o espectro de RMN de H do produto bruto indicou a formação da di-hidropiridina (IIb), na forma de 4 estereoisômeros. A oxazolidina IIa, como um isômero largamente majoritário, pôde ser obtida pela reação do tetrafluoroborato de N-metil-2,4,6-trifenilpiridínio (III) com p-clorobenzaldeído, na presença de uma solução diluída de álcali. Esta oxazolidina era bastante instável e não pode ser purificada, sendo submetida na forma bruta à reação de Diels-Alder com a N-metil-maleimida. Esta reação conduziu a dois adutos isoméricos (IV e V). Embora o aduto majoritário (V) fosse estável em solução de deutero-clorofórmio, o aduto minoritário (IV), na presença desse solvente e à temperatura ambiente, isomerizava-se após algumas horas. A estrutura dos três adutos foi determinada por experimentos de RMN de H (NOESY e NOE 1D seletivo). A adição de um pequeno volume de solução diluída de ácido clorídrico aos compostos IV e V, dissolvidos em acetonitrila e à temperatura ambiente, resultou na isomerização catalítica desses adutos. Porém, quando esta reação de protonação foi efetuada sob refluxo de acetonitrila, formaram-se dois produtos (VI e VII), cuja estrutura era compatível com ocorrência de uma reação de retro-aza Diels-Alder. Finalmente, foi estudado o equilíbrio conformacional de dois novos sais de 2,4,6-trifenil- piridínio, e os resultados foram comparados com aqueles obtidos para os sais análogos 2,4,6-trimetil-substituídos. / When the tetrafluoroborate of N-(&#945;-carbomethoxymethyl)-2,4,6-triphenylpridinium (Ia) was submitted to alkaline hydrolysis followed by decarboxylation upon heating, the resulting betaine failed to undergo the aldol addition reaction with aromatic aldehydes leading, in lieu of the expected oxazolidine (IIa),a salt bearing the cation N-methyl-2,4,6-triphenylpyridinium (III), as a result of the easy protonation of the intermediate ylide. However, for the corresponding a-methylated salt (Ib), the formation of four stereoisomeric 1,2- dihydropiridines was confirmed by inspection of the H NMR of the crude product. As an alternative to this method for obtaining IIa, a mixture of III and p-chlorobenzaldehyde was stirred at room temperature for several hours, in the presence of a diluted aqueous alkali. The resulting 1,2-dihidropyridine (IIa) was rather unstable precluding its isolation from the crude product mixture, and was submitted, without further purification, to the Diels-Alder reaction with Nmethylmaleimide, leading to two diastereomeric isoquinuclidines (IV) and (V). Although the major isomer showed to be stable in a deuterochloroform solution, the minor isomer (IV) underwent a spontaneous isomerization, upon standing in such solvent at room temperature. The stereochemical features of these three aducts could be accessed by NOESY and 1D NOE selective H NMR experiments. By treating a solution of adducts IV and V in acetonitrile with a small volume of aqueous HCl, at room temperature, an acid catalyzed isomerization took place. However, when the protonation reaction of the major diastereoisomer (V) was performed in acetonitrile at the reflux temperature, two products (VI and VII) were isolated, highlighting the occurrence of a retro-aza Diels Alder reaction. Finally, the conformation equilibria for two new 2,4,6-triphenyl- pyridinium salts was investigated. Results were correlated with previous ones referring to analogous 2,4,6-trimethyl- salts.

Quando o tetrafluoroborato de N-(&#945;-carbometoximetil)-2,4,6-trifenilpiridínio (Ia) foi tratado com hidróxido de potássio em etanol, resultou uma betaína que, ao ser aquecida na presença de benzaldeído ou p-clorobenzaldeído, não produziu a esperada oxazolidina IIa. Em lugar desta 1,2-di-hidropiridina, formou-se um sal cujo cátion correspondia à estrutura de um N-metil-2,4,6-trifenilpiridínio (III). Este composto resultaria da protonação da ilida intermediária, formada pela descarboxilação da betaína. Porém, quando o mesmo tipo de reação foi efetuada com o derivado &#945;-metilado Ib, o espectro de RMN de H do produto bruto indicou a formação da di-hidropiridina (IIb), na forma de 4 estereoisômeros. A oxazolidina IIa, como um isômero largamente majoritário, pôde ser obtida pela reação do tetrafluoroborato de N-metil-2,4,6-trifenilpiridínio (III) com p-clorobenzaldeído, na presença de uma solução diluída de álcali. Esta oxazolidina era bastante instável e não pode ser purificada, sendo submetida na forma bruta à reação de Diels-Alder com a N-metil-maleimida. Esta reação conduziu a dois adutos isoméricos (IV e V). Embora o aduto majoritário (V) fosse estável em solução de deutero-clorofórmio, o aduto minoritário (IV), na presença desse solvente e à temperatura ambiente, isomerizava-se após algumas horas. A estrutura dos três adutos foi determinada por experimentos de RMN de H (NOESY e NOE 1D seletivo). A adição de um pequeno volume de solução diluída de ácido clorídrico aos compostos IV e V, dissolvidos em acetonitrila e à temperatura ambiente, resultou na isomerização catalítica desses adutos. Porém, quando esta reação de protonação foi efetuada sob refluxo de acetonitrila, formaram-se dois produtos (VI e VII), cuja estrutura era compatível com ocorrência de uma reação de retro-aza Diels-Alder. Finalmente, foi estudado o equilíbrio conformacional de dois novos sais de 2,4,6-trifenil- piridínio, e os resultados foram comparados com aqueles obtidos para os sais análogos 2,4,6-trimetil-substituídos. / When the tetrafluoroborate of N-(&#945;-carbomethoxymethyl)-2,4,6-triphenylpridinium (Ia) was submitted to alkaline hydrolysis followed by decarboxylation upon heating, the resulting betaine failed to undergo the aldol addition reaction with aromatic aldehydes leading, in lieu of the expected oxazolidine (IIa),a salt bearing the cation N-methyl-2,4,6-triphenylpyridinium (III), as a result of the easy protonation of the intermediate ylide. However, for the corresponding a-methylated salt (Ib), the formation of four stereoisomeric 1,2- dihydropiridines was confirmed by inspection of the H NMR of the crude product. As an alternative to this method for obtaining IIa, a mixture of III and p-chlorobenzaldehyde was stirred at room temperature for several hours, in the presence of a diluted aqueous alkali. The resulting 1,2-dihidropyridine (IIa) was rather unstable precluding its isolation from the crude product mixture, and was submitted, without further purification, to the Diels-Alder reaction with Nmethylmaleimide, leading to two diastereomeric isoquinuclidines (IV) and (V). Although the major isomer showed to be stable in a deuterochloroform solution, the minor isomer (IV) underwent a spontaneous isomerization, upon standing in such solvent at room temperature. The stereochemical features of these three aducts could be accessed by NOESY and 1D NOE selective H NMR experiments. By treating a solution of adducts IV and V in acetonitrile with a small volume of aqueous HCl, at room temperature, an acid catalyzed isomerization took place. However, when the protonation reaction of the major diastereoisomer (V) was performed in acetonitrile at the reflux temperature, two products (VI and VII) were isolated, highlighting the occurrence of a retro-aza Diels Alder reaction. Finally, the conformation equilibria for two new 2,4,6-triphenyl- pyridinium salts was investigated. Results were correlated with previous ones referring to analogous 2,4,6-trimethyl- salts.