O estudo que ora se apresenta integrou o conjunto de pesquisas do sub-projeto - Diversidade de Bactérias Associadas à Degradação de Compostos Recalcitrantes, do projeto temático BIOTA FAPESP - Ecologia Molecular e Taxonomia Polifásica de Bactérias de Interesse Ambiental e Agro-Industrial. Apresenta caráter inovador, na medida em que procurou avaliar o potencial de aplicação biotecnológica de microrganismos anaeróbios de uma área severamente contaminada no Brasil, o estuário de Santos-São Vicente, em degradar o pentaclorofenol (PCP). A pergunta fundamental a ser respondida pelos resultados experimentais realizados foi: são os microrganismos autóctones do estuário capazes de servirem de inóculo para degradar o pentaclorofenol em biorreatores sob condições metanogênicas? Dois grupos de amostras foram avaliados, o primeiro, uma parcela composta por vários sedimentos coletados no estuário e, o segundo, sedimentos coletados na região do Largo de Canéus e na frente da Companhia Siderúrgica Paulista (COSIPA). O estabelecimento da determinação cromatográfica do PCP e congêneres menos clorados para o monitoramento experimental mostrou que na análise da presença dos clorofenóis nos sedimentos, o método de extração por ultrassom com posterior metilação dos analitos foi adequado para concentração mínima de 200 'mü'g clorofenóis/Kg sedimento para 2,3; 2,6 diclorofenóis; 2,4,6 e 2,3,6 triclorofenóis. Contudo, não foi adequado para a determinação do PCP e 2,3,4 triclorofenol. Para o meio de cultivo, o método de extração do PCP por agitação em vórtex e acetilação dos analitos mostrou-se adequado para todos os clorofenóis e com limite de quantificação de 0,1 mg/L. A avaliação do potencial metanogênico foi realizada com as amostras compostas do estuário enriquecidas sob condições halofílicas. O valor estável de metano no biogás de 50% foi obtido nos primeiros 20 dias de incubação. O sedimento nessas condições foi utilizado como inóculo para fins de isolamento de culturas metanogênicas, redutoras do íon sulfato e degradadoras de PCP. Não foram obtidas culturas desalogenadoras; porém foram isoladas arquéias metanogênicas, cultivadas em metanol, acetato e formiato de sódio, bem como bactérias cultivadas em lactato de sódio na presença e ausência de sulfato de sódio. Ensaios fisiológicos aliados aos métodos moleculares FISH e DGGE permitiram identificar arquéias metanogênicas do gênero Methanosarcina sp. e microrganismos do domínio Bacteria. Os sedimentos individualmente estudados foram coletados com maior controle de anaerobiose empregando-se amostrador do tipo corer. O enriquecimento destes sedimentos, inicialmente sob concentração de 2,5 mg PCP/g STV e com adições periódicas de 50% da concentração inicial do clorofenol e 1,25 a 2,5 g/L de glicose por 13 meses a 30 graus Celsius, resultou na obtenção de culturas degradadoras do PCP sob anaerobiose estrita. Nos reatores controles sem PCP, já primeiros 20 dias de incubação 70% de metano foi determinado no biogás. Nos reatores com PCP, a produção do metano (20%) iniciou após 100 dias. A adsorção foi o principal mecanismo de remoção de 50% do PCP nas primeiras 12 horas de incubação dos enriquecimentos. Posteriormente, a redução do PCP no meio de 77% para a amostra de Canéus e 70% para a da COSIPA foi relacionada a mecanismos de biodegradação anaeróbia, como a desalogenação redutiva. Exames microscópicos mostraram a seleção de microrganismos na presença de PCP, com predomínio de bacilos formadores de esporos semelhantes ao gênero Clostridium sp., filamentos diversos e filamentos semelhantes as arquéias metanogênicas acetoclásticas relacionadas ao gênero Methanosaeta sp. O enriquecimento foi realizado sob condições halofílicas, segunda a salinidade de cada amostra estudada no estuário. Não houve perda do clorofenol por volatilização. Os resultados obtidos no enriquecimento anterior viabilizaram o estudo seguro do potencial anaeróbio dos microrganismos oriundos do sedimento da COSIPA em metabolizar o PCP em reator contínuo do tipo RAHLF. Assim, sedimento enriquecido sob condições metanogênicas e halofílicas foi inoculado no RAHLF, controlando-se rigorosamente a anaerobiose. O reator preenchido com cubos de espuma de poliuretana foi operado por 126 dias e tempo de detenção hidráulica de 18 horas, com meio de cultura salino contendo glicose (1 g/L) como principal fonte de carbono e PCP-Na nas concentrações de 5, 13, 15 e 21 mg/L. O desempenho do RAHLF foi estável com boa eficiência durante toda a operação. A redução dos níveis de matéria orgânica medida em DQO variou de 70 a 100% e a de PCP foi de 99%, com detecção de intermediários menos clorados e sob teores de metano no biogás de 20%. Da massa de 1111,73 mg de PCP aplicada no reator, 286,9 mg ficou retida no sistema pelo processo de adsorção nas biopartículas e 824,83 mg foi biodegradada. As análises morfológicas dos tipos celulares, em conjunto com as técnicas moleculares DGGE e FISH, revelaram a presença de grupos microbianos do domínio Archaea pertencente à família Methanosarcinacea e grupos do domínio Bacteria. A participação de grupos de domínio Bacteria, cuja estrutura dos tipos microbianos na comunidade variou ao longo do RAHLF e das concentrações de PCP, e dos organismos metanogênicos da família Methanosarcinacea, possibilitou responder a questão inicialmente formulada, uma vez que se pode afirmar que os microrganismos autóctones foram capazes de degradar o PCP sob condições metanogênicas e halofílicas, com eficiência adequada. A prática para a seleção dos microrganismos retirados do ambiente estuarino, de interesse para biotecnologia anaeróbia aplicada ao saneamento ambiental, que empregou o reator do tipo RAHLF, parece promissora para avanços da engenharia na remediação biológica de uma área cuja relevância é indiscutível para o estado de São Paulo / This study has an innovative character, once aimed to evaluate the biotechnological application of anaerobic microorganisms degrading pentachlorophenol (PCP) at a severely polluted area in Brazil, estuary of Santos-São Vicente, São Paulo state. This study integrated a group of researches of the sub-project - Diversity of Bacteria Associated to the Degradation of Recalcitrant Compounds, supported by major project BIOTA FAPESP which theme is Molecular Ecology and Polyphasic Taxonomy of Bacteria of Environmental and Agriculture-Industrial Interest. The fundamental question to be answered by the accomplished experimental results was: are the autochthonus microorganisms of the estuary capable of serving as inoculum to degrade the PCP in bioreactors under methanogenic conditions? In order to evaluate this hypothesis, two groups of samples were collected: sediments taken from several sites of the estuary and sediments taken from two sites, one severely contaminated with organochlorine compounds, in front of the São Paulo Metallurgical Company (COSIPA) and other, less contaminated, in the area of Canéus. The establishment of protocol for the PCP and less chlorinated compounds chromatographic determination showed that the extraction method by ultrosonication followed by metilation of the chlorinated compounds was appropriated to evaluate concentrations of 200 ug chlorophenol/Kg of sediment, 2,3; 2,6 dichlorophenols; 2,4,6 and 2,3,6 trichlorophenols. However, it was not appropriated for evaluation of PCP and 2,3,4 trichlorophenol. For the culture medium, the extraction method by vortex agitation followed by acetilation was appropriated for all of the chlorophenols compounds. The quantification limit was 0,1 mg/L. The evaluation of the methanogenic potential and PCP biodegradation was accomplished with the samples of the estuary enriched under halophylic conditions. In the experiments without PCP was possible to obtain cultures of Methanosarcina sp, identified by FISH technique and cells of domain Bacteria, identified by DGGE. In the experiment with PCP dehalogenated cultures were not obtained. To evaluate PCP anaerobic biodegradation by sediments of COSIPA and Caneus sites, sediments collected under anaerobic conditions by a corer device were enriched in a halophylic brine medium with glucose and PCP at concentration of 2.5 mg PCP/g VTS. Periodic additions of 50% of the initial concentration of PCP and 1.25 to 2.5 g/L of glucose were done. With this strategy was possible to obtain PCP dehalogenated cultures. The adsorption was the main mechanism of 50% of PCP removal in the first 12 hours of incubation. The PCP reduction of 77% for Caneus reactor and 70% for COSIPA reactor was related to anaerobic biodegradation. Microscopic exams showed selection of microorganisms, with predominance of cells related to Clostridium sp., and filaments related to methanogenic acetoclastic archaea Methanosaeta sp. chlorophenols volatilization was not observed. The biotechnological application of HAIB reactor in PCP biodegradation was evaluated using sediment of COSIPA site previously enriched with glucose. The reactor was operated by 126 days and hydraulic detention time of 18 hours, with saline brine medium containing glucose (1 g/L) and NaPCP in concentrations of 5, 13, 15 and 21 mg/L. PCP amendments did not affect the overall performance and functional stability of the process. COD and PCP reduction was close to 80% and 100%, respectively with detection of trichlorophenols and dichlorophenols. Percentage of methane in the biogas closed to 30%. Adsorption analyses demonstrated that 287 mg of PCP was removed by adsorption in the biofilm and 825 mg was removed by biodegradation. Biofilm DGGE-profiling showed the presence of specific bands of Bacteria and Archaea domains when PCP was amended. The appearance of new bands of Bacteria showed that this organisms had a direct influence at PCP dehalogentation. Archaea organisms of Methanosarcinaceae family had an indirect influence in this metabolism. This thesis demonstrated that HAIB reactors, using autochthonous microorganisms under halophylic and methanogenic conditions, are a potential alternative for organochlorines bioremediation

O estudo que ora se apresenta integrou o conjunto de pesquisas do sub-projeto - Diversidade de Bactérias Associadas à Degradação de Compostos Recalcitrantes, do projeto temático BIOTA FAPESP - Ecologia Molecular e Taxonomia Polifásica de Bactérias de Interesse Ambiental e Agro-Industrial. Apresenta caráter inovador, na medida em que procurou avaliar o potencial de aplicação biotecnológica de microrganismos anaeróbios de uma área severamente contaminada no Brasil, o estuário de Santos-São Vicente, em degradar o pentaclorofenol (PCP). A pergunta fundamental a ser respondida pelos resultados experimentais realizados foi: são os microrganismos autóctones do estuário capazes de servirem de inóculo para degradar o pentaclorofenol em biorreatores sob condições metanogênicas? Dois grupos de amostras foram avaliados, o primeiro, uma parcela composta por vários sedimentos coletados no estuário e, o segundo, sedimentos coletados na região do Largo de Canéus e na frente da Companhia Siderúrgica Paulista (COSIPA). O estabelecimento da determinação cromatográfica do PCP e congêneres menos clorados para o monitoramento experimental mostrou que na análise da presença dos clorofenóis nos sedimentos, o método de extração por ultrassom com posterior metilação dos analitos foi adequado para concentração mínima de 200 'mü'g clorofenóis/Kg sedimento para 2,3; 2,6 diclorofenóis; 2,4,6 e 2,3,6 triclorofenóis. Contudo, não foi adequado para a determinação do PCP e 2,3,4 triclorofenol. Para o meio de cultivo, o método de extração do PCP por agitação em vórtex e acetilação dos analitos mostrou-se adequado para todos os clorofenóis e com limite de quantificação de 0,1 mg/L. A avaliação do potencial metanogênico foi realizada com as amostras compostas do estuário enriquecidas sob condições halofílicas. O valor estável de metano no biogás de 50% foi obtido nos primeiros 20 dias de incubação. O sedimento nessas condições foi utilizado como inóculo para fins de isolamento de culturas metanogênicas, redutoras do íon sulfato e degradadoras de PCP. Não foram obtidas culturas desalogenadoras; porém foram isoladas arquéias metanogênicas, cultivadas em metanol, acetato e formiato de sódio, bem como bactérias cultivadas em lactato de sódio na presença e ausência de sulfato de sódio. Ensaios fisiológicos aliados aos métodos moleculares FISH e DGGE permitiram identificar arquéias metanogênicas do gênero Methanosarcina sp. e microrganismos do domínio Bacteria. Os sedimentos individualmente estudados foram coletados com maior controle de anaerobiose empregando-se amostrador do tipo corer. O enriquecimento destes sedimentos, inicialmente sob concentração de 2,5 mg PCP/g STV e com adições periódicas de 50% da concentração inicial do clorofenol e 1,25 a 2,5 g/L de glicose por 13 meses a 30 graus Celsius, resultou na obtenção de culturas degradadoras do PCP sob anaerobiose estrita. Nos reatores controles sem PCP, já primeiros 20 dias de incubação 70% de metano foi determinado no biogás. Nos reatores com PCP, a produção do metano (20%) iniciou após 100 dias. A adsorção foi o principal mecanismo de remoção de 50% do PCP nas primeiras 12 horas de incubação dos enriquecimentos. Posteriormente, a redução do PCP no meio de 77% para a amostra de Canéus e 70% para a da COSIPA foi relacionada a mecanismos de biodegradação anaeróbia, como a desalogenação redutiva. Exames microscópicos mostraram a seleção de microrganismos na presença de PCP, com predomínio de bacilos formadores de esporos semelhantes ao gênero Clostridium sp., filamentos diversos e filamentos semelhantes as arquéias metanogênicas acetoclásticas relacionadas ao gênero Methanosaeta sp. O enriquecimento foi realizado sob condições halofílicas, segunda a salinidade de cada amostra estudada no estuário. Não houve perda do clorofenol por volatilização. Os resultados obtidos no enriquecimento anterior viabilizaram o estudo seguro do potencial anaeróbio dos microrganismos oriundos do sedimento da COSIPA em metabolizar o PCP em reator contínuo do tipo RAHLF. Assim, sedimento enriquecido sob condições metanogênicas e halofílicas foi inoculado no RAHLF, controlando-se rigorosamente a anaerobiose. O reator preenchido com cubos de espuma de poliuretana foi operado por 126 dias e tempo de detenção hidráulica de 18 horas, com meio de cultura salino contendo glicose (1 g/L) como principal fonte de carbono e PCP-Na nas concentrações de 5, 13, 15 e 21 mg/L. O desempenho do RAHLF foi estável com boa eficiência durante toda a operação. A redução dos níveis de matéria orgânica medida em DQO variou de 70 a 100% e a de PCP foi de 99%, com detecção de intermediários menos clorados e sob teores de metano no biogás de 20%. Da massa de 1111,73 mg de PCP aplicada no reator, 286,9 mg ficou retida no sistema pelo processo de adsorção nas biopartículas e 824,83 mg foi biodegradada. As análises morfológicas dos tipos celulares, em conjunto com as técnicas moleculares DGGE e FISH, revelaram a presença de grupos microbianos do domínio Archaea pertencente à família Methanosarcinacea e grupos do domínio Bacteria. A participação de grupos de domínio Bacteria, cuja estrutura dos tipos microbianos na comunidade variou ao longo do RAHLF e das concentrações de PCP, e dos organismos metanogênicos da família Methanosarcinacea, possibilitou responder a questão inicialmente formulada, uma vez que se pode afirmar que os microrganismos autóctones foram capazes de degradar o PCP sob condições metanogênicas e halofílicas, com eficiência adequada. A prática para a seleção dos microrganismos retirados do ambiente estuarino, de interesse para biotecnologia anaeróbia aplicada ao saneamento ambiental, que empregou o reator do tipo RAHLF, parece promissora para avanços da engenharia na remediação biológica de uma área cuja relevância é indiscutível para o estado de São Paulo / This study has an innovative character, once aimed to evaluate the biotechnological application of anaerobic microorganisms degrading pentachlorophenol (PCP) at a severely polluted area in Brazil, estuary of Santos-São Vicente, São Paulo state. This study integrated a group of researches of the sub-project - Diversity of Bacteria Associated to the Degradation of Recalcitrant Compounds, supported by major project BIOTA FAPESP which theme is Molecular Ecology and Polyphasic Taxonomy of Bacteria of Environmental and Agriculture-Industrial Interest. The fundamental question to be answered by the accomplished experimental results was: are the autochthonus microorganisms of the estuary capable of serving as inoculum to degrade the PCP in bioreactors under methanogenic conditions? In order to evaluate this hypothesis, two groups of samples were collected: sediments taken from several sites of the estuary and sediments taken from two sites, one severely contaminated with organochlorine compounds, in front of the São Paulo Metallurgical Company (COSIPA) and other, less contaminated, in the area of Canéus. The establishment of protocol for the PCP and less chlorinated compounds chromatographic determination showed that the extraction method by ultrosonication followed by metilation of the chlorinated compounds was appropriated to evaluate concentrations of 200 ug chlorophenol/Kg of sediment, 2,3; 2,6 dichlorophenols; 2,4,6 and 2,3,6 trichlorophenols. However, it was not appropriated for evaluation of PCP and 2,3,4 trichlorophenol. For the culture medium, the extraction method by vortex agitation followed by acetilation was appropriated for all of the chlorophenols compounds. The quantification limit was 0,1 mg/L. The evaluation of the methanogenic potential and PCP biodegradation was accomplished with the samples of the estuary enriched under halophylic conditions. In the experiments without PCP was possible to obtain cultures of Methanosarcina sp, identified by FISH technique and cells of domain Bacteria, identified by DGGE. In the experiment with PCP dehalogenated cultures were not obtained. To evaluate PCP anaerobic biodegradation by sediments of COSIPA and Caneus sites, sediments collected under anaerobic conditions by a corer device were enriched in a halophylic brine medium with glucose and PCP at concentration of 2.5 mg PCP/g VTS. Periodic additions of 50% of the initial concentration of PCP and 1.25 to 2.5 g/L of glucose were done. With this strategy was possible to obtain PCP dehalogenated cultures. The adsorption was the main mechanism of 50% of PCP removal in the first 12 hours of incubation. The PCP reduction of 77% for Caneus reactor and 70% for COSIPA reactor was related to anaerobic biodegradation. Microscopic exams showed selection of microorganisms, with predominance of cells related to Clostridium sp., and filaments related to methanogenic acetoclastic archaea Methanosaeta sp. chlorophenols volatilization was not observed. The biotechnological application of HAIB reactor in PCP biodegradation was evaluated using sediment of COSIPA site previously enriched with glucose. The reactor was operated by 126 days and hydraulic detention time of 18 hours, with saline brine medium containing glucose (1 g/L) and NaPCP in concentrations of 5, 13, 15 and 21 mg/L. PCP amendments did not affect the overall performance and functional stability of the process. COD and PCP reduction was close to 80% and 100%, respectively with detection of trichlorophenols and dichlorophenols. Percentage of methane in the biogas closed to 30%. Adsorption analyses demonstrated that 287 mg of PCP was removed by adsorption in the biofilm and 825 mg was removed by biodegradation. Biofilm DGGE-profiling showed the presence of specific bands of Bacteria and Archaea domains when PCP was amended. The appearance of new bands of Bacteria showed that this organisms had a direct influence at PCP dehalogentation. Archaea organisms of Methanosarcinaceae family had an indirect influence in this metabolism. This thesis demonstrated that HAIB reactors, using autochthonous microorganisms under halophylic and methanogenic conditions, are a potential alternative for organochlorines bioremediation