Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1875030 bytes, checksum: 2c2c1497d43bb10ad7e10f009f941c57 (MD5) Previous issue date: 2006-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Geminiviruses constitute a large group of plant virus whose genome is packed as single-stranded DNA circles in a small, twinned isometric particle and is converted to double- stranded forms in nuclei of differentiated plant cells. Members of the genus Begomovirus, such as Cabbage leaf curl virus (CaLCuV), possess two genomic components, DNA-A and DNA-B. The DNA-A has the potential to code for five gene products (AV1, AC1, AC2, AC3, AC4) and is involved in replication, transcriptional activation of viral genes and encapsidation of the viral genome. The DNA-B encodes two movement proteins, the movement protein MP (BC1) and the nuclear shuttle protein NSP (BV1), both required for systemic infection. NSP shuttles the viral DNA between the nucleus and the cytoplasm and then acts cooperatively with MP to move the viral DNA cell-to-cell across the wall. The localization of NSP and its proposed role in cell-to-cell movement of the viral DNA predict that interactions with host factors may occur in both the cytoplasm and the nucleus. In fact, NSP has been demonstrated to interact with a plasma membrane receptor protein, designated NIK, and a nuclear acetyltransferase. A proline-rich extensin-like receptor protein kinase (PERK) was found to interact specifically with NSP of CaLCuV and of tomato-infecting geminiviruses, through yeast two-hybrid screening. The PERK-like protein, which we designated NsAK (NSP-associated kinase), is structurally organized into a proline-rich N-terminal domain followed by a transmembrane segment and a C-terminal serine/threonine kinase domain. The viral protein interacted stably with defective versions of the NsAK kinase domain but not with the potentially active enzyme in an in vitro binding assay. In vitro translated NsAK enhanced the phosphorylation level of NSP, indicating that NSP functions as substrate for NsAK. These results demonstrated that NsAK is an authentic serine/threonine kinase and suggested a functional link for the NSP-NsAK complex formation. This interpretation was corroborated by in vivo infectivity assays showing that loss of NsAK function delays the onset of CaLCuV infection and attenuates symptom development. Our data implicate NsAK as a positive contributor to geminivirus infection and suggest it may regulate NSP function. / Geminivírus constitui um grande grupo de vírus de planta, cujo genoma é empacotado na forma de DNA circular fita simples em partículas icosaédricas geminadas e é convertido em uma forma fita dupla no núcleo de células diferenciadas de plantas. A maioria dos membros do gênero Begomovirus, como o Cabbage leaf curl vírus (CaLCuV), possuem dois componentes genômicos, DNA-A e DNA-B. O DNA-A apresenta o potencial para codificar cinco produtos gênicos (AV1, AC1, AC2, AC3, AC4) e está envolvido na replicação, ativação transcricional de genes virais e encapsidação do genoma viral. O DNA-B codifica duas proteínas de movimento, Movement Protein MP (BC1) e Nuclear Shuttle Protein NSP (BV1), ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e então atua cooperativamente com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular. A localização de NSP e seu papel proposto no movimento célula- a-célula do DNA viral predizem que podem ocorrer interações com fatores do hospedeiro tanto no citoplasma quanto no núcleo. De fato, foi demonstrado que NSP interage com uma proteína receptora da membrana plasmática, designada NIK, e uma acetiltransferase nuclear. Através de ensaio de duplo híbrido, foi identificada, uma PERK quinase ( proline-rich extensin-like receptor protein kinase ) de Arabidopsis thaliana que interage especificamente com NSP de CaLCuV e, também de geminivírus que infectam tomate, a qual foi designada NsAK ( NSP-associated kinase ) e é estruturalmente organizada em um domínio N-terminal rico em prolina seguido de um segmento transmembrana e de um domínio C-terminal de serina/treonina quinase. A proteína viral interagiu estavelmente com versões defectivas do domínio de quinase de NsAK, mas não com a enzima potencialmente ativa em um ensaio de ligação in vitro. NsAK traduzida in vitro aumentou o nível de fosforilação de NSP, indicando que NSP atua como substrato de NsAK. Estes resultados demonstram que NsAK é uma autêntica serina/treonina quinase e sugerem elo funcional para a formação do complexo NSP-NsAK. Esta interpretação foi corroborada por ensaios de infectividade in vivo, demonstrando que a perda de função de NsAK reduz a eficiência da infecção por CaLCuV e atenua o desenvolvimento dos sintomas. Estes dados implicam NsAK como um contribuidor positivo para a infecção por geminivírus e sugerem que NsAK pode regular a função de NSP.