Thesis advisor: Charles Hoffman / The study of mammalian cAMP signaling has often been confounded by the fact that ten different genes encode adenylyl cyclases (ACs) that produce cAMP from ATP and 16 different genes encode phosphodiesterases (PDEs) that hydrolyze cAMP to AMP. In this study, mammalian AC cDNAs were cloned and integrated into strains of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe that lack their endogenous AC to determine the basal activity of all ten AC isoforms. In addition, response to the stimulatory mammalian Gsα was determined by co-expression of a mutationally-activated form of the human GNAS1 gene. AC activity was assessed using an fbp1-GFP reporter that is repressed by cAMP production and PKA activity. Results confirm that all ten isoforms have detectable basal activity, and AC1-9 definitively respond to Gsα stimulation. When matched with a sufficiently potent mammalian phosphodiesterase (PDE), strains expressing mammalian ACs make good candidates for small molecule high throughput screening (HTS) to detect AC inhibitors. A 100,000 compound screen was recently performed to detect AC and Gsα inhibitors as well as PDE activators. A promising “hit” was progesterone, which has been previously suggested to inhibit ACs in Xenopus. Initial results suggest that progesterone inhibits AC1 and the closely-related AC3. These data demonstrate the utility of using S. pombe as an effective platform for identifying inhibitors of both basal and GNAS1-stimulated AC activity. / Thesis (BS) — Boston College, 2015. / Submitted to: Boston College. College of Arts and Sciences. / Discipline: Departmental Honors. / Discipline: Biology.

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Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A diferenciação da oligodendroglia depende de alterações coordenadas no citoesqueleto e na sua relação com a membrana plasmática, um componente importante para a formação da bainha de mielina. A 23 nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) está relacionada com a organização do citoesqueleto, sendo uma proteína ancoradoura de microtúbulos na membrana plasmática. In vitro, a CNPase compõe, com a F-actina e os microtúbulos, as estruturas semelhantes a nervuras ou os componentes radiais. A glicoproteína associada a mielina (MAG), também é importante para a formação dos véus de membrana e está associada a CNPase e a tubulina. Além disso, as três proteínas podem ser reguladas pela via de sinalização do AMPc/PKA. Buscando avaliar os efeitos da via do AMPc/PKA na regulação da diferenciação oligodendroglial, culturas de hemisférios cerebrais com 5 dias foram tratadas por 30 min ou 24 h com o inibidor (SQ22356-SQ [1 M]) ou com o ativador (forscolina [10M]) da adenilato ciclase ou com o inibidor da PKA, H-89 [1 M]. A oligodendroglia foi identificada pelo anticorpo anti-CNPase e por sua morfologia. Com 30 min de tratamento com forscolina, as células das culturas tratadas apresentaram prolongamentos maiores e menos véus de membrana quando comparadas às culturas controle. O tratamento com SQ também causou um aumento no tamanho dos prolongamentos e o tratamento com H-89 causou a redução no tamanho dos prolongamentos e nos véus de membrana. Com 24 h, as células tratadas com forscolina apresentaram poucos prolongamentos, já as culturas tratadas com SQ apresentaram um aumento no tamanho do prolongamento e as tratadas com H-89 demonstraram redução no véu de membrana. Observamos também alterações na distribuição da CNPase, tubulina e MAG, a primeira apresentou uma concentração próxima ao núcleo depois dos dois tempos de tratamento com H-89, o mesmo ocorreu com a tubulina. A CNPase adquiriu ainda um padrão puntiforme depois de 24 h de tratamento com ambos os inibidores. A MAG apresentou um aumento na concentração próximo ao núcleo depois de 30 min de tratamento com forscolina e SQ. O tratamento com SQ também reduziu a distribuição da MAG nos véus de membrana. A mesma redução foi observada depois de 24 h de tratamento com H-89. Esses resultados reforçam a participação da via do AMPc/PKA no desenvolvimento da oligodendroglia, incluindo a formação dos prolongamentos, suas ramificações e ainda a formação dos véus de membrana, com prováveis consequências na formação e manutenção da bainha de mielina. / Oligodendroglial differentiation depends on coordinated changes in the cytoskeleton and on its relationship with the plasmatic membrane, a critical site regarding the formation of the myelin sheath. 23cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase (CNPase) is related to cytoskeleton modulation, anchoring microtubules to the plasmatic membrane. In vitro, CNPase composes, together with F-actin and microtubules, the vein-like structures or radial components in myelin sheath. Myelin associated glycoprotein (MAG) is important to membrane vellum formation and is associated with CNPase and tubulin. Besides, the AMPc/PKA pathway can regulate these three proteins. In order to evaluate the effects of the cAMP/PKA pathway modulation on oligodendroglial differentiation, cultures of cerebral hemispheres were treated for 30 min or 24 h with the adenylyl cyclase inhibitor SQ22536 SQ [1 lM] or with its activator forskolin [10 lM], or with the PKA inhibitor H-89 [1 lM]. Oligodendroglia was identified using anti-CNPase antibody as also by morphology. At 30 min, the cells treated with forskolin showed bigger processes and a shorter membrane vellum when compared to control cultures, the treatment with SQ caused an increase in the processes length, the H-89 treatment reduced the processes length and the membrane vellum. At 24 h, cultures treated with forskolin showed few processes when compared to control cultures. Cultures treated with SQ showed an increase in the processes length and after H89 treatment oligodendroglial cells presented a reduction in the membrane vellum. We also observed alterations in the distribution of CNPase, tubulin and MAG, the first showed an increase in the distribution closest to nucleus in both periods of H-89 treatment, the same pattern occurred for tubulin. The CNPase acquired a punctiform pattern after 24 hours of treatment with both inhibitors. The MAG also showed an increase closest to nucleus after 30 minutes of treatment with forskolin and SQ. The SQ treatment also caused a reduction in the protein distribution to membrane vellum. The same reduction is observed after 24 hours of treatment with H-89.These findings reinforce a role for AMPc/PKA pathway in oligodendroglial differentiation including the processes extension and arborization as also the formation of membranar vellum, with possible consequences in the formation and maintenance of myelin sheath.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A diferenciação da oligodendroglia depende de alterações coordenadas no citoesqueleto e na sua relação com a membrana plasmática, um componente importante para a formação da bainha de mielina. A 23 nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) está relacionada com a organização do citoesqueleto, sendo uma proteína ancoradoura de microtúbulos na membrana plasmática. In vitro, a CNPase compõe, com a F-actina e os microtúbulos, as estruturas semelhantes a nervuras ou os componentes radiais. A glicoproteína associada a mielina (MAG), também é importante para a formação dos véus de membrana e está associada a CNPase e a tubulina. Além disso, as três proteínas podem ser reguladas pela via de sinalização do AMPc/PKA. Buscando avaliar os efeitos da via do AMPc/PKA na regulação da diferenciação oligodendroglial, culturas de hemisférios cerebrais com 5 dias foram tratadas por 30 min ou 24 h com o inibidor (SQ22356-SQ [1 M]) ou com o ativador (forscolina [10M]) da adenilato ciclase ou com o inibidor da PKA, H-89 [1 M]. A oligodendroglia foi identificada pelo anticorpo anti-CNPase e por sua morfologia. Com 30 min de tratamento com forscolina, as células das culturas tratadas apresentaram prolongamentos maiores e menos véus de membrana quando comparadas às culturas controle. O tratamento com SQ também causou um aumento no tamanho dos prolongamentos e o tratamento com H-89 causou a redução no tamanho dos prolongamentos e nos véus de membrana. Com 24 h, as células tratadas com forscolina apresentaram poucos prolongamentos, já as culturas tratadas com SQ apresentaram um aumento no tamanho do prolongamento e as tratadas com H-89 demonstraram redução no véu de membrana. Observamos também alterações na distribuição da CNPase, tubulina e MAG, a primeira apresentou uma concentração próxima ao núcleo depois dos dois tempos de tratamento com H-89, o mesmo ocorreu com a tubulina. A CNPase adquiriu ainda um padrão puntiforme depois de 24 h de tratamento com ambos os inibidores. A MAG apresentou um aumento na concentração próximo ao núcleo depois de 30 min de tratamento com forscolina e SQ. O tratamento com SQ também reduziu a distribuição da MAG nos véus de membrana. A mesma redução foi observada depois de 24 h de tratamento com H-89. Esses resultados reforçam a participação da via do AMPc/PKA no desenvolvimento da oligodendroglia, incluindo a formação dos prolongamentos, suas ramificações e ainda a formação dos véus de membrana, com prováveis consequências na formação e manutenção da bainha de mielina. / Oligodendroglial differentiation depends on coordinated changes in the cytoskeleton and on its relationship with the plasmatic membrane, a critical site regarding the formation of the myelin sheath. 23cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase (CNPase) is related to cytoskeleton modulation, anchoring microtubules to the plasmatic membrane. In vitro, CNPase composes, together with F-actin and microtubules, the vein-like structures or radial components in myelin sheath. Myelin associated glycoprotein (MAG) is important to membrane vellum formation and is associated with CNPase and tubulin. Besides, the AMPc/PKA pathway can regulate these three proteins. In order to evaluate the effects of the cAMP/PKA pathway modulation on oligodendroglial differentiation, cultures of cerebral hemispheres were treated for 30 min or 24 h with the adenylyl cyclase inhibitor SQ22536 SQ [1 lM] or with its activator forskolin [10 lM], or with the PKA inhibitor H-89 [1 lM]. Oligodendroglia was identified using anti-CNPase antibody as also by morphology. At 30 min, the cells treated with forskolin showed bigger processes and a shorter membrane vellum when compared to control cultures, the treatment with SQ caused an increase in the processes length, the H-89 treatment reduced the processes length and the membrane vellum. At 24 h, cultures treated with forskolin showed few processes when compared to control cultures. Cultures treated with SQ showed an increase in the processes length and after H89 treatment oligodendroglial cells presented a reduction in the membrane vellum. We also observed alterations in the distribution of CNPase, tubulin and MAG, the first showed an increase in the distribution closest to nucleus in both periods of H-89 treatment, the same pattern occurred for tubulin. The CNPase acquired a punctiform pattern after 24 hours of treatment with both inhibitors. The MAG also showed an increase closest to nucleus after 30 minutes of treatment with forskolin and SQ. The SQ treatment also caused a reduction in the protein distribution to membrane vellum. The same reduction is observed after 24 hours of treatment with H-89.These findings reinforce a role for AMPc/PKA pathway in oligodendroglial differentiation including the processes extension and arborization as also the formation of membranar vellum, with possible consequences in the formation and maintenance of myelin sheath.

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The cAMP/protein kinase A (PKA) signaling pathway has been shown to be important in controlling morphological changes and the pathogenicity of several pathogenic fungi. Evidence also highlights the importance of the cAMP/PKA pathway in the morphological transition of Paracoccidioides. PKA is the major effector of this signaling pathway. The protein is an inactive tetramer composed of regulatory subunit, encoded by the BCY1 gene; and catalytic subunit, encoded by the TPK2 gene. Upon binding of cAMP to the regulatory subunits, the catalytic subunits dissociate and become active. Activated PKA subsequently phosphorylates protein kinases, transcription factors, and other substrates to control several biological processes. In this study, we evaluated the expression and interactions of Tpk2 protein Paracoccididioides spp. The Tpk2 is present in mycelium decreased during the initial stages of transition phases, and increases again at the end of differentiation, with maximal levels in yeast. We analyzed the interactions of recombinant Tpk2p with Paracoccidioides proteins using pull-down assays followed by MS analysis. Two interacting proteins were identified: the heat shock protein 90 (Hsp90) and a conserved hypothetical protein with a MFS domain. Hsp90 is involved in the regulation of morphogenesis, development and virulence in several thermal dimorphic fungi. These data are important for understanding the mechanisms that trigger the transition phases in Paracoccidioides. / O gênero Paracoccidioides compreende um complexo de fungos patogênicos, que são os agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente na América Latina. A infecção inicia-se com a inalação de propágulos do fungo, que atingem o epitélio dos alvéolos pulmonares, onde ocorre à transição da forma de micélio para a forma patogênica, de levedura. Há evidências de que a temperatura seja o principal fator responsável pela diferenciação celular desses fungos, e sua patogenicidade é frequentemente associada com a transição dimórfica. A via de sinalização cAMP/ proteína quinase A (PKA) controla alterações morfológicas e de virulência/patogenicidade em várias espécies de fungos patogênicos humanos. Evidências apontam também para a importância da via cAMP/PKA em Paracoccidioides spp. A PKA é o principal efetor desta via de sinalização. A proteína na forma inativa é um tetrâmero composto de subunidade regulatória, codificada pelo gene BCY1; e subunidade catalítica, codificada pelo gene TPK2. Após a ligação de cAMP às subunidades regulatórias, as subunidades catalíticas dissociam-se e tornam-se ativas. Ativada a PKA fosforila proteína-quinases, fatores de transcrição, e outros substratos para controlar diversos processos biológicos. Neste estudo, avaliamos a expressão e as interações da proteína Tpk2 de Paracoccididioides spp. A Tpk2 está presente em micélio, diminui nos estágios iniciais da transição de fases e volta a aumentar no final da diferenciação, apresentando níveis máximos na levedura. Foram analisadas as interações de Tpk2p recombinante com proteínas de Paracoccidioides utilizando ensaios de pull-down, seguido por análise de MS. Foram identificadas duas proteínas que interagem: a proteína de choque térmico 90 (Hsp90) e uma proteína hipotética conservada com um domínio MFS. Hsp90 está envolvido na regulação da morfogênese, desenvolvimento e virulência em vários fungos dimórficos térmicos. Estes dados são importantes para entendimento dos mecanismos que disparam a transição de fases em Paracoccidioides spp.