As micobactérias compreendem um grupo de organismos que são heterogêneos em termos de metabolismo, crescimento, nicho ambiental, epidemiologia, patogenicidade, distribuição geográfica e associação com doenças. O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio aos laboratórios. Com a descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos, tem sido cada vez mais difícil identificar com precisão estas espécies. Uma questão básica na identificação em micobactérias é a diferenciação entre o Complexo Mycobacterium tuberculosis e as Micobactérias Não Causadoras de Tuberculose (MNT); no entanto tem sido cada vez mais importante a diferenciação das MNT. Em virtude das semelhanças fenotípicas e genotípicas, é necessário a aplicação e desenvolvimento de metodologias que melhor caracterizem as MNT para que seja possível determinar de forma mais precisa a prevalência das diferentes espécies. Além disso, diferentes espécies de MNT podem apresentar diferenças no perfil de sensibilidade às drogas terapêuticas, sendo que a identificação precisa é crucial para a adoção de terapia medicamentosa adequada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os isolados de MNT através da comparação entre duas técnicas moleculares, a técnica de PRA-hsp65 e um kit comercial GenoType® Mycobacterium CM, usando o método de sequenciamento do gene hsp65 como padrãoouro. Foram analisadas 96 isolados e a concordância entre os resultados do PRA-hsp65 e do GenoType® Mycobacterium CM foi de 92%. O método molecular PRA-hsp65 mostrou-se eficaz na identificação das espécies em 91% das amostras e o GenoType® Mycobacterium CM em 92%. Em relação aos custos referentes aos dois métodos, foi possível estabelecer que o PRA-hsp65 apresentou um valor final consideravelmente inferior ao do GenoType® Mycobacterium CM. No entanto, a técnica comercial necessita um prazo mais curto (2 dias) para ser realizada em comparação com a técnica PRA-hsp65 (requer 5 dias). Na nossa avaliação, a aplicabilidade do PRA-hsp65 aumenta a qualidade e rapidez do resultado final, já que se mostrou discriminatório, de baixo custo e relativamente de fácil execução na identificação de micobactérias. É possível concluir que ambas as técnicas moleculares avaliadas neste estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação de MNT, sendo que a implementação destas técnicas dependerá das características dos diferentes laboratórios bem como as necessidades clínicas das diferentes instituições. / Mycobacteria comprise a group of organisms that are heterogeneous in terms of metabolism, growth, environmental niche, epidemiology, pathogenicity, geographic distribution and disease association. The laboratory diagnosis of mycobacteria is currently a challenge to laboratories. Due to the increased description of new species of mycobacteria in recent years it is becoming difficult to accurately identify these species. A basic question in the identification of mycobacteria is the differentiation between Mycobacterium tuberculosis and the Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM); however it has been increasingly important to differentiate the NTM species. Due to the fact that there are phenotypic and genotypic similarities, it is necessary to apply and develop methodologies to better characterize the NTM to be able to determine more accurately the prevalence of different species. Furthermore, different NTM species may differ in the profile of sensitivity to therapeutic drugs, and accurate identification is crucial for the adoption of appropriate drug therapy. The objective of this study was to characterize NTM isolates by comparing two molecular techniques, the technique of PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) and a commercial kit GenoType® Mycobacterium CM, using the sequencing the hsp65 gene as gold standard. We analyzed 96 samples and the concordance between the results of the PRA-hsp65 and the GenoType® Mycobacterium CM was 92%. The PRA-hsp65 molecular method proved to be effective in 91% of species identification and the GenoType® Mycobacterium CM in 92%. Regarding costs for the two methods, we could establish that the PRA-hsp65 had a final value considerably lower than the GenoType® Mycobacterium CM. However, the commercial technique requires a shorter period (2 days) to be performed in comparison with the technique PRA-hsp65 (requires five days). In our evaluation, the applicability of the PRA-hsp65 increases the quality and speed of the final result (in relation to traditional phenotypic identification or outsourcing in referral centers), and proved to be discriminatory, inexpensive and relatively easy to perform the identification of mycobacteria. Finally, we conclude that both molecular techniques evaluated in this study showed a great capacity for identification of NTM and that the implementation of these techniques. However, depend on the characteristics of different laboratories as well as the clinical needs of different institutions.

As micobactérias compreendem um grupo de organismos que são heterogêneos em termos de metabolismo, crescimento, nicho ambiental, epidemiologia, patogenicidade, distribuição geográfica e associação com doenças. O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio aos laboratórios. Com a descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos, tem sido cada vez mais difícil identificar com precisão estas espécies. Uma questão básica na identificação em micobactérias é a diferenciação entre o Complexo Mycobacterium tuberculosis e as Micobactérias Não Causadoras de Tuberculose (MNT); no entanto tem sido cada vez mais importante a diferenciação das MNT. Em virtude das semelhanças fenotípicas e genotípicas, é necessário a aplicação e desenvolvimento de metodologias que melhor caracterizem as MNT para que seja possível determinar de forma mais precisa a prevalência das diferentes espécies. Além disso, diferentes espécies de MNT podem apresentar diferenças no perfil de sensibilidade às drogas terapêuticas, sendo que a identificação precisa é crucial para a adoção de terapia medicamentosa adequada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os isolados de MNT através da comparação entre duas técnicas moleculares, a técnica de PRA-hsp65 e um kit comercial GenoType® Mycobacterium CM, usando o método de sequenciamento do gene hsp65 como padrãoouro. Foram analisadas 96 isolados e a concordância entre os resultados do PRA-hsp65 e do GenoType® Mycobacterium CM foi de 92%. O método molecular PRA-hsp65 mostrou-se eficaz na identificação das espécies em 91% das amostras e o GenoType® Mycobacterium CM em 92%. Em relação aos custos referentes aos dois métodos, foi possível estabelecer que o PRA-hsp65 apresentou um valor final consideravelmente inferior ao do GenoType® Mycobacterium CM. No entanto, a técnica comercial necessita um prazo mais curto (2 dias) para ser realizada em comparação com a técnica PRA-hsp65 (requer 5 dias). Na nossa avaliação, a aplicabilidade do PRA-hsp65 aumenta a qualidade e rapidez do resultado final, já que se mostrou discriminatório, de baixo custo e relativamente de fácil execução na identificação de micobactérias. É possível concluir que ambas as técnicas moleculares avaliadas neste estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação de MNT, sendo que a implementação destas técnicas dependerá das características dos diferentes laboratórios bem como as necessidades clínicas das diferentes instituições. / Mycobacteria comprise a group of organisms that are heterogeneous in terms of metabolism, growth, environmental niche, epidemiology, pathogenicity, geographic distribution and disease association. The laboratory diagnosis of mycobacteria is currently a challenge to laboratories. Due to the increased description of new species of mycobacteria in recent years it is becoming difficult to accurately identify these species. A basic question in the identification of mycobacteria is the differentiation between Mycobacterium tuberculosis and the Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM); however it has been increasingly important to differentiate the NTM species. Due to the fact that there are phenotypic and genotypic similarities, it is necessary to apply and develop methodologies to better characterize the NTM to be able to determine more accurately the prevalence of different species. Furthermore, different NTM species may differ in the profile of sensitivity to therapeutic drugs, and accurate identification is crucial for the adoption of appropriate drug therapy. The objective of this study was to characterize NTM isolates by comparing two molecular techniques, the technique of PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) and a commercial kit GenoType® Mycobacterium CM, using the sequencing the hsp65 gene as gold standard. We analyzed 96 samples and the concordance between the results of the PRA-hsp65 and the GenoType® Mycobacterium CM was 92%. The PRA-hsp65 molecular method proved to be effective in 91% of species identification and the GenoType® Mycobacterium CM in 92%. Regarding costs for the two methods, we could establish that the PRA-hsp65 had a final value considerably lower than the GenoType® Mycobacterium CM. However, the commercial technique requires a shorter period (2 days) to be performed in comparison with the technique PRA-hsp65 (requires five days). In our evaluation, the applicability of the PRA-hsp65 increases the quality and speed of the final result (in relation to traditional phenotypic identification or outsourcing in referral centers), and proved to be discriminatory, inexpensive and relatively easy to perform the identification of mycobacteria. Finally, we conclude that both molecular techniques evaluated in this study showed a great capacity for identification of NTM and that the implementation of these techniques. However, depend on the characteristics of different laboratories as well as the clinical needs of different institutions.

As micobactérias compreendem um grupo de organismos que são heterogêneos em termos de metabolismo, crescimento, nicho ambiental, epidemiologia, patogenicidade, distribuição geográfica e associação com doenças. O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio aos laboratórios. Com a descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos, tem sido cada vez mais difícil identificar com precisão estas espécies. Uma questão básica na identificação em micobactérias é a diferenciação entre o Complexo Mycobacterium tuberculosis e as Micobactérias Não Causadoras de Tuberculose (MNT); no entanto tem sido cada vez mais importante a diferenciação das MNT. Em virtude das semelhanças fenotípicas e genotípicas, é necessário a aplicação e desenvolvimento de metodologias que melhor caracterizem as MNT para que seja possível determinar de forma mais precisa a prevalência das diferentes espécies. Além disso, diferentes espécies de MNT podem apresentar diferenças no perfil de sensibilidade às drogas terapêuticas, sendo que a identificação precisa é crucial para a adoção de terapia medicamentosa adequada. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os isolados de MNT através da comparação entre duas técnicas moleculares, a técnica de PRA-hsp65 e um kit comercial GenoType® Mycobacterium CM, usando o método de sequenciamento do gene hsp65 como padrãoouro. Foram analisadas 96 isolados e a concordância entre os resultados do PRA-hsp65 e do GenoType® Mycobacterium CM foi de 92%. O método molecular PRA-hsp65 mostrou-se eficaz na identificação das espécies em 91% das amostras e o GenoType® Mycobacterium CM em 92%. Em relação aos custos referentes aos dois métodos, foi possível estabelecer que o PRA-hsp65 apresentou um valor final consideravelmente inferior ao do GenoType® Mycobacterium CM. No entanto, a técnica comercial necessita um prazo mais curto (2 dias) para ser realizada em comparação com a técnica PRA-hsp65 (requer 5 dias). Na nossa avaliação, a aplicabilidade do PRA-hsp65 aumenta a qualidade e rapidez do resultado final, já que se mostrou discriminatório, de baixo custo e relativamente de fácil execução na identificação de micobactérias. É possível concluir que ambas as técnicas moleculares avaliadas neste estudo apresentaram uma ótima capacidade de identificação de MNT, sendo que a implementação destas técnicas dependerá das características dos diferentes laboratórios bem como as necessidades clínicas das diferentes instituições. / Mycobacteria comprise a group of organisms that are heterogeneous in terms of metabolism, growth, environmental niche, epidemiology, pathogenicity, geographic distribution and disease association. The laboratory diagnosis of mycobacteria is currently a challenge to laboratories. Due to the increased description of new species of mycobacteria in recent years it is becoming difficult to accurately identify these species. A basic question in the identification of mycobacteria is the differentiation between Mycobacterium tuberculosis and the Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM); however it has been increasingly important to differentiate the NTM species. Due to the fact that there are phenotypic and genotypic similarities, it is necessary to apply and develop methodologies to better characterize the NTM to be able to determine more accurately the prevalence of different species. Furthermore, different NTM species may differ in the profile of sensitivity to therapeutic drugs, and accurate identification is crucial for the adoption of appropriate drug therapy. The objective of this study was to characterize NTM isolates by comparing two molecular techniques, the technique of PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) and a commercial kit GenoType® Mycobacterium CM, using the sequencing the hsp65 gene as gold standard. We analyzed 96 samples and the concordance between the results of the PRA-hsp65 and the GenoType® Mycobacterium CM was 92%. The PRA-hsp65 molecular method proved to be effective in 91% of species identification and the GenoType® Mycobacterium CM in 92%. Regarding costs for the two methods, we could establish that the PRA-hsp65 had a final value considerably lower than the GenoType® Mycobacterium CM. However, the commercial technique requires a shorter period (2 days) to be performed in comparison with the technique PRA-hsp65 (requires five days). In our evaluation, the applicability of the PRA-hsp65 increases the quality and speed of the final result (in relation to traditional phenotypic identification or outsourcing in referral centers), and proved to be discriminatory, inexpensive and relatively easy to perform the identification of mycobacteria. Finally, we conclude that both molecular techniques evaluated in this study showed a great capacity for identification of NTM and that the implementation of these techniques. However, depend on the characteristics of different laboratories as well as the clinical needs of different institutions.

Os complexos Mycobacterium chelonae M.abscessus e Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum são compostos por espécies bacterianas de crescimento rápido e potencialmente patogênicas. Sua distribuição é ubíqua no ambiente, são resistentes a cloração da água e a sua replicação ocorre mesmo em condições de escassez de nutrientes. Estão envolvidos em casos de infecção pulmonar e extrapulmonar, e causam infecções em pacientes imunocomprometidos ou submetidos a rocedimentos cirúrgicos invasivos. Os objetivos do presente trabalho foram: confirmar através de testes fenotípicos e com as técnicas de PRA hsp65 e seqüenciamento do fragmento do rpoB, a identificação de micobactérias de crescimento rápido, incluídas nos complexos M. chelonae-M.abscessus e M. fortuitum-M.peregrinum. Foram incluídos no estudo os isolados provenientes de pacientes com dois ou mais isolamentos provenientes de sítio não estéril ou um isolamento de sítio estéril. O estudo de 38 isolados demonstrou que as provas fenotípicas disponíveis atualmente não permitem a identificação de todas as espécies de micobactérias de crescimento rápido já descritas na literatura. O PRA hsp65 possibilitou a identificação rápida e precisa de 63% das espécies de micobactérias e demonstrou um perfil compartilhado pelas espécies M. abscessus 2; M. bolletii 1 e M. massiliense 1. O seqüenciamento do gene rpoB confirmou a identificação das espécies citadas. Nossos resultados demonstraram que o PRA-hsp65 e o seqüenciamento do gene rpoB são ferramentas úteis para fornecer a identificação das espécies de micobactérias com mais acurácia. O uso dessas técnicas poderiam ser consideradas em laboratórios de referência para identificar Micobactérias de crescimento rápido uma vez que elas são patógenos emergentes implicados em surtos e isolados de pacientes em centros de referência para tratamento de tuberculose multirresistente. / Mycobacterium chelonae-M. abscessus and Mycobacterium fortuitum-M. peregrinum complexes are composed by bacterial species characterized by rapid grow and considered as potential pathogens. These microorganisms are ubiquitous in the environment, resistant to water treatment such as standard chlorination and are able to replicate even at poor nutrient conditions. They are related to lung and extralung infections in immune-compromised patients or those submitted to invasive surgical procedures. The aim of this study was to confirm the identification of Mycobacterium chelonae - M. abscessus and Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum complexes, isolated from biological samples considering one or two repetitions if samples are originated from sterile or non-sterile site respectively. Phenotypic tests and molecular methods, PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing, were applied to identify 38 strains previously isolated. Results demonstrated that available phenotypic tests did not allow the identification of all described fast growing Mycobacterium. The PRA of hsp65 gene confirmed the identification of 63% of the Mycobacterium studied, and demonstrated the band pattern shared by M. abscessus 2, M. bolletii and M. massiliensis. The rpoB gene sequencing confirmed the identification of the species cited. Our results demonstrated that PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing are useful tools to provide a more accurate species identification of mycobacteria. The use of such techniques would be considered in reference laboratories to identify fast growing Mycobacterium species since they are considered emerging pathogens implicated in outbreaks and isolated from a patient in reference centers for treatment of multidrug resistant tuberculosis.

Os complexos Mycobacterium chelonae M.abscessus e Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum são compostos por espécies bacterianas de crescimento rápido e potencialmente patogênicas. Sua distribuição é ubíqua no ambiente, são resistentes a cloração da água e a sua replicação ocorre mesmo em condições de escassez de nutrientes. Estão envolvidos em casos de infecção pulmonar e extrapulmonar, e causam infecções em pacientes imunocomprometidos ou submetidos a rocedimentos cirúrgicos invasivos. Os objetivos do presente trabalho foram: confirmar através de testes fenotípicos e com as técnicas de PRA hsp65 e seqüenciamento do fragmento do rpoB, a identificação de micobactérias de crescimento rápido, incluídas nos complexos M. chelonae-M.abscessus e M. fortuitum-M.peregrinum. Foram incluídos no estudo os isolados provenientes de pacientes com dois ou mais isolamentos provenientes de sítio não estéril ou um isolamento de sítio estéril. O estudo de 38 isolados demonstrou que as provas fenotípicas disponíveis atualmente não permitem a identificação de todas as espécies de micobactérias de crescimento rápido já descritas na literatura. O PRA hsp65 possibilitou a identificação rápida e precisa de 63% das espécies de micobactérias e demonstrou um perfil compartilhado pelas espécies M. abscessus 2; M. bolletii 1 e M. massiliense 1. O seqüenciamento do gene rpoB confirmou a identificação das espécies citadas. Nossos resultados demonstraram que o PRA-hsp65 e o seqüenciamento do gene rpoB são ferramentas úteis para fornecer a identificação das espécies de micobactérias com mais acurácia. O uso dessas técnicas poderiam ser consideradas em laboratórios de referência para identificar Micobactérias de crescimento rápido uma vez que elas são patógenos emergentes implicados em surtos e isolados de pacientes em centros de referência para tratamento de tuberculose multirresistente. / Mycobacterium chelonae-M. abscessus and Mycobacterium fortuitum-M. peregrinum complexes are composed by bacterial species characterized by rapid grow and considered as potential pathogens. These microorganisms are ubiquitous in the environment, resistant to water treatment such as standard chlorination and are able to replicate even at poor nutrient conditions. They are related to lung and extralung infections in immune-compromised patients or those submitted to invasive surgical procedures. The aim of this study was to confirm the identification of Mycobacterium chelonae - M. abscessus and Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum complexes, isolated from biological samples considering one or two repetitions if samples are originated from sterile or non-sterile site respectively. Phenotypic tests and molecular methods, PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing, were applied to identify 38 strains previously isolated. Results demonstrated that available phenotypic tests did not allow the identification of all described fast growing Mycobacterium. The PRA of hsp65 gene confirmed the identification of 63% of the Mycobacterium studied, and demonstrated the band pattern shared by M. abscessus 2, M. bolletii and M. massiliensis. The rpoB gene sequencing confirmed the identification of the species cited. Our results demonstrated that PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing are useful tools to provide a more accurate species identification of mycobacteria. The use of such techniques would be considered in reference laboratories to identify fast growing Mycobacterium species since they are considered emerging pathogens implicated in outbreaks and isolated from a patient in reference centers for treatment of multidrug resistant tuberculosis.