Orientador: Daniel Carneiro Carrettiero. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012.

Orientador: Prof. Dr. Daniel Carneiro Carrettiero / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2014. / As inclusões de Tau fosforilada são o principal marcador das doenças neurodegenerativas classificadas como taupatias, sendo a doença de Alzheimer (DA) a forma mais prevalente. A presença de ubiquitina nas inclusões de Tau é uma evidência para um defeito em sua degradação, pois proteínas ubiquitinadas são prontamente degradadas pelo proteassoma. A proteína BAG2 é um co-chaperona conhecida por ter como alvo a degradação da Tau por uma via mais eficiente que a via dependente da ubiquitina. Sabendo que a redução da temperatura leva a fosforilação de Tau, o presente estudo investiga se a co-chaperona BAG2, em condição de hipotermia, tem participação no aumento da Tau fosforilada. Utilizando a linhagem de células SH-SY5Y não diferenciadas e diferenciadas (expressão do gene MAP2 como controle) como um modelo, nós demonstramos o efeito da redução de temperatura, de 37°C a 34°C, sobre a expressão do mRNA BAG2 via PCR em tempo real. Para confirmar o efeito de BAG2 na degradação de Tau fosforilada (pTau), foram avaliados os níveis de Tau fosforilada através de Western blot. Ao comparar a expressão de BAG2 entre células indiferenciadas e diferenciadas, verificamos uma redução da expressão de BAG2 mRNA, sugerindo que BAG2 tem sua expressão suprimida na diferenciação. A redução de temperatura causou uma redução significativa da expressão de BAG2 em células não diferenciadas, enquanto em células diferenciadas não demonstrou nenhuma diferença. Este resultado sugere a existência de um limiar de expressão de BAG2. Tal como esperado, a redução de temperatura em células não diferenciadas, que mostraram a maior inibição de BAG2, causou um aumento significativo na fosforilação de Tau. Da mesma forma, nenhum efeito sobre células diferenciadas foi visto ao reduzir a temperatura, pois não haviam demonstrado diminuição significativa na expressão BAG2. Curiosamente, embora BAG2 seja sempre reduzida em células diferenciadas em relação a não diferenciadas, independentemente da temperatura, a 37°C não existe nenhuma diferença nos níveis de pTau entre as células indiferenciadas e diferenciadas. Além disso, a diminuição dos níveis de pTau entre as células não diferenciadas e diferenciadas em 34°C sugere que a fosforilação da Tau é regulada de modo diferente em células diferenciadas, de forma que pode ser desvinculada expressão de BAG2. Foi observado também em células não diferenciadas que a super expressão de BAG2 submetida a redução de temperatura resgatou o aumento na fosforilação da Tau. Este resultado sugere uma relação direta entre a redução da temperatura, a redução da expressão BAG2 e o aumento nos níveis de proteína Tau fosforilada em células indiferenciadas. Estes dados suportam a hipótese de que as mudanças na temperatura podem conduzir a uma modificação condicional de vias celulares relacionados com a progressão das taupatias. / The presence of inclusions of phosphorylated Tau is a hallmark of many neurodegenerative disorders classified as "tauopathy," of which Alzheimer's disease (AD) is the most prevalent form. The abundance of ubiquitin on Tau inclusions points to a defect in Tau protein clearance since ubiquitinated proteins are promptly degraded by proteasome. The BAG2 protein is a co-chaperone that targets phosphorylated Tau for degradation by a more-efficient ubiquitin-independent pathway. Given that temperature reduction leads to Tau hyperphosphorylation, the present study investigates if the co-chaperone BAG2 participates in the cold-induced up-regulation of phosphorylated Tau. Using undifferentiated and differentiated MAP2-expressing SH-SY5Y cells as a model, we demonstrated the effects of temperature reduction, from 37°C to 34°C, on BAG2 mRNA expression via realtime PCR. To confirm an effect of BAG2 at the protein level, we tested levels of phosphorylated Tau via Western blot. When comparing BAG2 expression between differentiated cells and undifferentiated cells, a decrease in BAG2 mRNA suggests that BAG2 is downregulated on differentiation. Cold treatment of undifferentiated cells caused a significant decrease in BAG2 expression, while cold treatment of differentiated cells did not yield a significant decrease. This result suggests that inhibition of BAG2 expression via either of these mechanisms approaches a limiting threshold. As expected, cold treatment of undifferentiated cells, which showed the greatest inhibition of BAG2, caused a significant increase in phosphorylated Tau protein. Similarly, no effect on Tau phosphorylation was seen on cold treatment of differentiated cells, which had shown no significant decrease in BAG2 expression. Interestingly, although BAG2 is always reduced in differentiated cells relative to undifferentiated, irrespective of temperature, at 37°C there is no difference in pTau levels between undifferentiated and differentiated cells. Further, a decrease in pTau levels between undifferentiated and differentiated cells at 34°C suggests that Tau phosphorylation is differently regulated in differentiated cells, in a manner that may be uncoupled to BAG2 expression. Next, we overexpressed BAG2 in undifferentiated cells that were next subjected to cold treatment, and observed that BAG2 overexpression was able to rescue the increase in Tau phosphorylation that accompanied the temperature-dependent decrease in BAG2. This result suggests a direct link between temperature-dependent inhibition of BAG2 expression and an increase in levels of phosphorylated Tau protein in undifferentiated cells. These data support the hypothesis that changes in temperature can lead to a conditional modification of cellular pathways related to tauopathies progression.