Pseudomonas aeruginosa (Pa) est un pathogène opportuniste et constitue un facteur de morbidité et de mortalité important chez les patients atteints de fibrose kystique II est responsable d'infections pulmonaires chroniques. Sa capacité à se maintenir chez l'hôte et à causer des infections résulte de l'expression de nombreux facteurs de virulence. Le traitement à l'aide d'antibiotiques fonctionne pour une durée limitée selon la capacité de Pa à développer de la résistance. Il est donc impératif de trouver d'autres alternatives afin de traiter les patients atteints de ce type d'infections chroniques. Les peptides antibactériens sont une des avenues envisagées puisque leurs cibles sont différentes et qu'ils n'engendrent pas de résistance. Par contre, les modes d'action des peptides antibactériens comme la pré-élafine sont encore mal connus. La pré-élafine est une protéine humaine sécrétée notamment par les cellules épithéliales. Elle possède des propriétés inhibitrices contre certaines peptidases à serine ainsi que des propriétés antimicrobiennes contre différentes souches de levures et de bactéries, incluant Pa. Nous avons étudié le mode d'action antibactérien de la pré-élafine contre Pa à l'aide de différentes approches. Nous avons d'abord observé que toutes les souches de Pa ne sont pas affectées de la même manière par la pré-élafine. La souche PA33348 est particulièrement sensible. Nous avons montré que cette hypersensibilité résulte de l'inhibition spécifique par le domaine élafine d'une peptidase sécrétée par cette souche, la peptidase IV, ce qui, affecte la croissance et/ou la viabilité en milieu complexe. Nous avons également montré que la pré-élafine et chacun de ses deux domaines se lie aux membranes. Le domaine N-terminal, ou cementoïne, qui est polycationique se lie plus particulièrement aux membranes chargées négativement. À l'aide de différentes techniques dont le dichroïsme circulaire et la résonance magnétique nucléaire, nous avons montré que ce domaine est peu structuré en solution aqueuse, mais adopte une conformation en hélices a dans un environnement hydrophobe. Cette caractéristique est commune à un grand nombre de peptides antimicrobiens, la plupart ayant la capacité de détruire l'intégrité des membranes microbiennes. Toutefois, et contrairement à ces peptides, les domaines cementoïne, élafine et la pré-élafine ne possèdent qu'une faible activité lytique. Par contre, nos résultats suggèrent que la pré-élafine aurait la capacité de traverser les membranes biologiques sans causer de lyse. Bien que d'autres expériences soient nécessaires pour confirmer cette hypothèse de la translocation au travers des membranes de la pré-élafine, nous avons montré que in vitro le domaine élafine et la pré-élafine, mais non la cementoïne, peuvent se lier à l'ADN. De plus nous avons noté une corrélation entre cette caractéristique et le fait que ces deux peptides permettent de diminuer l'expression de plusieurs facteurs de virulence de Pa. En résumé, nos travaux ont contribué à mieux comprendre les mécanismes d'action de la pré-élafine contre Pa. Cette protéine pourrait devenir une solution dans le traitement des patients atteints de fibrose kystique. Des études à l'aide de modèles animaux seraient le moyen idéal de confirmer notre travail et poursuivre la recherche sur le potentiel thérapeutique de la pré-élafine ou de ses domaines.

L’impact des infections bactériennes couplé à l’émergence des mécanismes de résistance aux antibiotiques suscite un besoin urgent de nouvelles classes d’agents antibactériens. D’ailleurs, la résistance du pathogène opportuniste P. aeruginosa diminue l’efficacité de traitement et met en danger la vie des personnes infectées. Dans le but d’identifier de nouveaux antimicrobiens, nous exploitons la machinerie de division cellulaire bactérienne en tant que cible. Ainsi, les protéines de division cellulaire FtsZ et FtsA de P. aeruginosa ont été utilisées afin d’identifier des inhibiteurs protéiques spécifiques à l’aide de la technique de présentation phagique. Nous avons identifié des peptides détenant une affinité pour les enzymes FtsZ et FtsA puis nous avons caractérisé 3 peptides inhibiteurs de l’activité GTPase de FtsZ. Le peptidomimétisme devrait permettre le développement d’une nouvelle classe d’agents antimicrobiens à partir de ces peptides. / The impact of bacterial infections and emergence of antibiotic resistance led to a serious need to develop new class of antibacterials. The acute resistance of the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa lowers the treatment efficiency of infected cystic fibrosis patients and immuno-compromised individuals. In the perspective of finding new antimicrobial agents, we are using the bacterial cell division machinery of as a new target. Thus, P. aeruginosa cell division proteins FtsZ and FtsA have been used to identify inhibitory peptides with the phage-display technique. We identified FtsZ and FtsA tight binding peptides and we characterized three inhibitory peptides of FtsZ GTPase activity. Peptidomimetism will allow the development of new antimicrobial agents with these leader peptides.

Cystic fibrosis (CF) is one of the most common genetic diseases in Europe and North America. Chronic bacterial infections with Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) are common among CF patients and are associated with increased disease progression among patients. While inflammation is considered to be a key driver of lung function decline, the precise mechanisms at play have remained unclear. The objective of this thesis was to evaluate the role of inflammatory signalling components that result in host cell death during respiratory infections observed in CF. First, I investigated the differences in inflammatory mechanisms and cytokine expression induced by P. aeruginosa isolated from early versus chronic infections in CF. I found that early respiratory isolates of P. aeruginosa from CF patients induced inflammasome signalling, cell death, and IL-1β expression by THP-1 macrophages, yet little expression of other proinflammatory cytokines. However, P. aeruginosa isolates from chronic infections induced relatively less THP-1 macrophage inflammasome signalling, cell death, and IL-1β expression but greater production of other cytokines. Using laboratory reference strains and various mutants of P. aeruginosa, I validated how due to their inability to induce early and extensive host cell death, isolates from chronic infections are able to induce sustained levels of proinflammatory cytokines, which may contribute to the pathogenesis observed in CF. I then investigated one specific virulence factor identified among clinical P. aeruginosa isolates, the effector protein ExoU. ExoU is known to induce rapid host cell death and has previously been described to be an inhibitor of caspase-1, limiting IL-1β secretion in immune cells. Using relevant laboratory reference strains, I have shown that ExoU is able to induce IL-1β expression at lower multiplicities of infection or at earlier time points than described in previous reports when infecting THP-1 macrophages and NuLi-1 bronchial epithelial cells. Through immunoblotting and the use of relevant inhibitors, it was found that this observed difference could be partially dependent on the activation of various caspases, including ones that induced canonical and non-canonical inflammasome activation. Overall, this described work adds to our understanding of respiratory infections observed among CF patients and could shed light on possible therapeutic options to reduce disease progression.

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Pseudomonas aeruginosa uses type IV pili (T4P) to colonize various materials and for surface-associated twitching motility. We previously identified five phylogenetically-distinct alleles of pi/A in P. aeruginosa, four of which occur in genetic cassettes with specific accessory genes (Kus et al., Microbiology 150:1315-1326, 2004). Each of the five pilin alleles, with and without its associated pilin accessory gene, was used to complement a group II PA01 pi/A mutant. Expression of group I or IV pi/A genes restored twitching motility to the same extent as the PA01 group II pilin. In contrast, complementation with group Ill or group V pi/A genes resulted in poor twitching that increased significantly when the cognate tfp Y or tfpZ accessory genes were cointroduced. The enhanced motility was linked to an increase in recoverable surface pili, and not to alterations in total pilin pools. Expression of the pilin genes, with or without accessory genes, in a PA01 pi/A-pi/T double mutant background resulted in expression of large amounts of surface pili, suggesting that the accessory proteins function to modulate pilin retraction dynamics. Reduction of twitching motility and surface piliation was also observed a tfpYknockout mutant of group Ill strain PA14, confirming that the accessory proteins enhance pilus assembly on the cell surface. The accessory proteins are specific for their cognate pilins; a PilAv-TfpY chimera produced few surface pili, resembling the phenotype of PA01 complemented with pi!Av alone. The linkage between specific pilin and accessory genes may be evolutionarily conserved because the accessory proteins antagonize pilus retraction, increasing pilus expression on the cell surface and thereby enhancing function. / Thesis / Master of Science (MSc)

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