<p>PSI-N is one of the subunits in eukaryotic Photosystem I (PSI) and is located on the lumenal side of the thylakoid membrane. It is known to interact in the electron transport chain between plastocyanin and PSI, but the mechanism behind the interaction is still unclear. To achieve a better understanding of PSI-N´s role in the photosynthesis it is necessary to develop a method for purification of PSI-N. The goal with this project was to design a plasmid that encodes a fusion protein containing PSI-N. With use of proteases the fusion protein can be cleaved into purified PSI-N. The initial material was cDNA, encoding PsaN from Arabidopsis thaliana, this was cloned into a pET32a Xa/LIC vector (from Novagen). The vector was then transformed into a Escherichia coli (E. coli) host. Finally the fusion protein was expressed and successfully isolated. </p><p>PSI-N är en av subenheterna i Photosystem I (PSI) hos eukaryoter och är lokaliserad på lumensidan av thylakoidmembranet. Det är klargjort att PSI-N på något sätt interagerar i elektron-transportkedjan mellan plastocyanin och PSI, men mekanismen bakom interaktionen är fortfarande okänd. För att förstå på vilket sätt PSI-N medverkar i fotosyntesen krävs en metod för att renframställa PSI-N i större mängd. Målet med det här projektet var att konstruera en plasmid som kodar för ett fusionsprotein innehållande PSI-N. Fusionsproteinet kan sedan klyvas av ett proteas, så att man får fram rent PSI-N. En cDNA kodande för PsaN från Arabidopsis thaliana klonades i vektorn pET32a Xa/LIC (från Novagen), och konstruktionen transformerades in i en Escherichia coli (E. coli) värd. Fusionsproteinet uttrycktes samt isolerades slutligen med lyckat resultat.</p>

PSI-N is one of the subunits in eukaryotic Photosystem I (PSI) and is located on the lumenal side of the thylakoid membrane. It is known to interact in the electron transport chain between plastocyanin and PSI, but the mechanism behind the interaction is still unclear. To achieve a better understanding of PSI-N´s role in the photosynthesis it is necessary to develop a method for purification of PSI-N. The goal with this project was to design a plasmid that encodes a fusion protein containing PSI-N. With use of proteases the fusion protein can be cleaved into purified PSI-N. The initial material was cDNA, encoding PsaN from Arabidopsis thaliana, this was cloned into a pET32a Xa/LIC vector (from Novagen). The vector was then transformed into a Escherichia coli (E. coli) host. Finally the fusion protein was expressed and successfully isolated. PSI-N är en av subenheterna i Photosystem I (PSI) hos eukaryoter och är lokaliserad på lumensidan av thylakoidmembranet. Det är klargjort att PSI-N på något sätt interagerar i elektron-transportkedjan mellan plastocyanin och PSI, men mekanismen bakom interaktionen är fortfarande okänd. För att förstå på vilket sätt PSI-N medverkar i fotosyntesen krävs en metod för att renframställa PSI-N i större mängd. Målet med det här projektet var att konstruera en plasmid som kodar för ett fusionsprotein innehållande PSI-N. Fusionsproteinet kan sedan klyvas av ett proteas, så att man får fram rent PSI-N. En cDNA kodande för PsaN från Arabidopsis thaliana klonades i vektorn pET32a Xa/LIC (från Novagen), och konstruktionen transformerades in i en Escherichia coli (E. coli) värd. Fusionsproteinet uttrycktes samt isolerades slutligen med lyckat resultat.

<p>A method describing the expression and purification of PSI-N together with fusion protein, using affinity chromatography and TEV protease. Although the method proved successful, optimization is still needed due to partial degradation of PSI-N.</p>

A method describing the expression and purification of PSI-N together with fusion protein, using affinity chromatography and TEV protease. Although the method proved successful, optimization is still needed due to partial degradation of PSI-N.

<p>Fotosyntesen kallas den process som omvandlar ljusenergi till kemisk energi. Fotosyntesen sker i tylakoidmembranet och drivs av två stora proteinkomplex, fotosystem II (PSII) och fotosystem I (PSI) då de tillförs energi i form av fotoner. PSI-N är ett mindre protein på ca 10 kDa som ingår i PSI. På något sätt, som ännu inte är klarlagt, samverkar PSI-N med PSI-F och plastocyanin när det dockar till PSI. Det är därför av viktigt att rena fram större mängder av PSI-N för att få djupare kunskaper om proteinet samt dess struktur och funktioner. Tidigare undersökningar har utförts i ämnet och ett fusionsprotein innehållande PSI-N har uttryckts i <em>Escherichia coli</em> (<em>E.coli</em>). Problem har dock uppstått efter lysis av cellerna då det har visat sig att fusionsproteinet har degraderats. Vårt examensarbete strävar efter att rena fram intakt fusionsprotein med hjälp av, framför allt, mekanisk lysis och proteasinhibitorer.</p> / <p>The process where light is converted into chemical energy is called photosyntesis. The reaction takes place in the thylakoid membrane and is driven by two major protein complexes, photosystem II (PSII) and photosystem I (PSI) when energy in form of photons are received. PSI-N, a subunit in PSI, is a smaller protein with a mass of approximately 10 kDa. In some way, which is not yet clarified, PSI-N collaborates with PSI-F and plastocyanin when plastocyanin is docking to PSI. It is therefore important to purify larger amounts of the protein to acquire deeper knowledge of its structure and function. In earlier research the PSI-N protein has been expressed in <em>Escherichia coli</em> (<em>E.coli</em>). The problem has been degradation of the fusion protein after lysis. Our goal with this project is to obtain the purified protein intact using mechanic lysis and protease inhibitors.</p>

Fotosyntesen kallas den process som omvandlar ljusenergi till kemisk energi. Fotosyntesen sker i tylakoidmembranet och drivs av två stora proteinkomplex, fotosystem II (PSII) och fotosystem I (PSI) då de tillförs energi i form av fotoner. PSI-N är ett mindre protein på ca 10 kDa som ingår i PSI. På något sätt, som ännu inte är klarlagt, samverkar PSI-N med PSI-F och plastocyanin när det dockar till PSI. Det är därför av viktigt att rena fram större mängder av PSI-N för att få djupare kunskaper om proteinet samt dess struktur och funktioner. Tidigare undersökningar har utförts i ämnet och ett fusionsprotein innehållande PSI-N har uttryckts i Escherichia coli (E.coli). Problem har dock uppstått efter lysis av cellerna då det har visat sig att fusionsproteinet har degraderats. Vårt examensarbete strävar efter att rena fram intakt fusionsprotein med hjälp av, framför allt, mekanisk lysis och proteasinhibitorer. / The process where light is converted into chemical energy is called photosyntesis. The reaction takes place in the thylakoid membrane and is driven by two major protein complexes, photosystem II (PSII) and photosystem I (PSI) when energy in form of photons are received. PSI-N, a subunit in PSI, is a smaller protein with a mass of approximately 10 kDa. In some way, which is not yet clarified, PSI-N collaborates with PSI-F and plastocyanin when plastocyanin is docking to PSI. It is therefore important to purify larger amounts of the protein to acquire deeper knowledge of its structure and function. In earlier research the PSI-N protein has been expressed in Escherichia coli (E.coli). The problem has been degradation of the fusion protein after lysis. Our goal with this project is to obtain the purified protein intact using mechanic lysis and protease inhibitors.