INTRODUÇÃO: O bócio é um termo genérico usado para descrever o aumento no volume da glândula tireoide que pode estar associado à formação de múltiplos nódulos, o chamado bócio multinodular. Camundongos transgênicos tireoide específicos com depleção do Pten ou aumento de expressão do Dream, dois importantes genes que têm sido implicados nas vias de sinalização das células foliculares, apresentam desenvolvimento de bócio. Em humanos, uma larga porcentagem de pacientes com doença de Cowden apresentam bócio ou outras anormalidades tireoidianas associadas a mutações germinativas no PTEN. OBJETIVO: O objetivo desse estudo foi investigar a expressão dos genes PTEN e DREAM em tecido hiperplásico tireoidiano, bem como mutações germinativas e somáticas no PTEN e mutações somáticas no DREAM, em pacientes portadores de bócio multinodular, com a finalidade de avaliar o papel destes genes na etiologia do bócio. MÉTODOS: Foram investigados 60 pacientes com bócio multinodular (54 mulheres). A extração do DNA genômico foi realizada a partir de tecido hiperplásico da tireoide e do sangue periférico dos pacientes enquanto o RNA foi obtido apenas do tecido glandular. A quantificação relativa do RNA mensageiro do PTEN e do DREAM foi avaliada pelo método de 2-??Ct utilizando o GAPDH como normalizador em dados produzidos pela PCR em tempo real. A alta e a baixa expressão de PTEN e DREAM foram definidas, respectivamente, por valores de quantificação superiores a 2.0 e inferiores a 0.5 em comparação a um pool comercial de RNA de tireoide normal de humanos. Análise de mutação foi realizada por amplificação da região codificante dos genes PTEN e DREAM pela PCR convencional seguida por sequenciamento automático (RQ = quantificação relativa; x? = média e DP = desvio padrão). RESULTADOS: Foi observada alta expressão do PTEN em 58,3% dos pacientes portadores de bócio (x RQ = 3,81; DP = 2,26) enquanto apenas dois casos apresentaram baixa expressão (x? RQ = 0,34; DP= 0,09). Nos 38,3% casos restantes foi observada expressão normal de PTEN (x? RQ = 1,35; DP = 0,35). Em relação ao gene DREAM, alta e baixa expressão foram observadas em 33,3% (x RQ = 6,07; DP = 5,02) e 15,0% (x RQ = 0,30; DP = 0,10) dos pacientes com bócio respectivamente, enquanto pouco mais da metade dos casos (51,6%) teve expressão normal RQ = 1,12 ; DP = 0,40). A Análise de mutações do PTEN e do DREAM revelaram apenas polimorfismos intrônicos, previamente descritos no banco de dados do NCBI, tanto nos DNA de sangue e/ou de tecido hiperplásico. CONCLUSÕES: Nossos resultados demonstraram uma expressão aumentada de PTEN em bócio multinodular, sugerindo que este pode estar hiperexpresso, ou pelo menos tem sua expressão mantida, nesta hiperplasia benigna da tireoide. Alterações na sequência gênica codificante do PTEN não foram observadas. Na análise mutacional e de expressão do DREAM não foram encontradas alterações que pudessem ser relacionadas à patogênese de bócio em humanos / BACKGROUND: Multinodular goiter is a clinicopathological entity characterized by an increased volume of the thyroid gland with formation of nodules. A high proliferative status of thyroid follicular cells and goiter were observed in mutants mice with specifically deleted Pten or Dream overexpression in thyrocytes. In humans, a large percentage of patients with Cowden disease have goiters or other thyroid abnormalities associated with germ-line PTEN mutations. OBJECTIVE: The aim of this study was to investigate the tissue expression of PTEN and DREAM, as well as germ-line and somatic PTEN mutations and somatic DREAM mutations, in patients with multinodular goiter to evaluated the role of these genes in goitrogenesis. METHODS: We investigated 60 multinodular goiter patients (54 females). Genomic DNA was extracted from both patients\' hyperplastic thyroid tissue and peripheral blood whereas RNA was obtained only from glandular tissue. Relative quantification of PTEN and DREAM messenger RNA was evaluated using 2-Ct method normalized to GAPDH expression on data produced by real-time PCR. PTEN and DREAM over and lower expression were respectively defined by value > 2.0-fold and < 0.5-fold relative to a commercial pool of normal human thyroid RNA. Mutations analyses were performed by amplification of PTEN and DREAM coding region by PCR followed by automatic sequencing. RQ = relative quantification; x = average; SD = standard deviation. RESULTS: We observed a high expression of PTEN in 58.3% of multinodular goiter patients (RQ x = 3.81; SD = 2.26) and only two cases with lower expression (RQ x = 0.34; SD = 0.09). In the remaining 38.3% of patients expression of PTEN was normal (RQ x = 1.35; SD = 0.35). For the DREAM, over and lower expression were observed in 33.3% (RQ x = 6.07; SD = 5.02) and 15.0% (RQ x = 0.30; SD = 0.10) of patients respectively, whereas 51.6% had normal expression (RQ x = 1.12; SD = 0.40). Regarding PTEN and DREAM mutations analysis, only previously described intronic polymorphisms were observed in DNA from blood and/or thyroid hyperplastic tissue. CONCLUSIONS: Our results demonstrated that PTEN expression is higher in multinodular goiter suggesting that this gene is overregulated (or at least has its expression maintained) in this benign hyperplastic thyroid lesions. No evidence for the involvement of DREAM in goitrogenesis was observed in our cohort of multinodular goiter patients

INTRODUÇÃO: Os carcinomas HER-2 positivos representam cerca de 20- 30% de todos os tumores da mama e se caracterizam por curso clínico mais agressivo, com alta proliferação celular e resistência a apoptose, determinados por cascatas de sinalizações intracelulares, tais como a via PI3K/AKT. O trastuzumabe, um anticorpo monoclonal humanizado que se liga à molécula de HER-2, é o tratamento padrão destas pacientes. A resposta a monoterapia com trastuzumabe varia de 12-30% e a persistência da ativação da via PI3K/AKT é um dos mecanismos de resistência. A ativação do AKT começa com a fosforilação do PIP2 a PIP3 pela PI3K. A desfosforilação do PIP3 é mediada pela PTEN e sua deficiência é um dos fatores possivelmente implicados na resistência ao trastuzumabe. Além da resistência à terapêutica, os tumores HER-2 positivos são heterogêneos quanto ao seu comportamento biológico. A busca de diferentes padrões morfológicos e moleculares neste grupo de carcinomas pretende identificar subgrupos prognósticos e preditivos, permitindo a individualização terapêutica. OBJETIVOS: Estudar a expressão imunoistoquímica de duas moléculas da via de sinalização PI3K/AKT (PTEN e AKT fosforilada) e explorar a via de sinalização androgênica através da expressão do receptor de androgênio e dos perfis morfológico e molecular apócrinos. METODOLOGIA: O estudo foi retrospectivo com revisão dos preparados histológicos e construção de blocos de microarranjos com amostras dos tumores para estudo imunoistoquímico. Na revisão foram avaliados: tipo histológico, características morfológicas apócrinas, presença de componente in situ, graus histológico e nuclear, receptores de estrogênio e progesterona, e atividade proliferativa através da expressão imunoistoquímica do Ki-67. Os preparados histológicos foram submetidos à pesquisa de PTEN, AKT fosforilada e receptor de androgênio. Pacientes, familiares e médicos foram contatados para recuperação do seguimento e evolução. RESULTADOS: Foram estudadas 104 pacientes portadoras de carcinoma primário da mama. A expressão de PTEN esteve reduzida em 20/104 (19,2%) dos casos e foi mais freqüente nos tumores com AKT positivo (p= 0,06). O grupo de tumores sem perda de expressão de PTEN apresentou maior atividade proliferativa. A AKT foi positiva em 71/104 (68,3%) casos e se associou a maior grau de diferenciação e à expressão de receptor de androgênio. O receptor de androgênio foi positivo em 89/104 (85,6%) dos casos e esteve associado ao menor grau histológico (p=0,018), receptor de estrogênio (p=0,008) e menor atividade proliferativa (p=0,001). A ausência da expressão do receptor de estrogênio (perfil molecular apócrino) foi identificada em 41/104 casos (39,4%) e se associou a tumores com grau histológico mais alto. O perfil morfológico apócrino foi identificado em 71 (68,3%) dos casos e se associou a alto grau histológico e nuclear. O seguimento foi possível em 55 casos e observamos tendência a menor sobrevida livre de doença nos tumores AKTpositivos e RA-negativos. CONCLUSÕES: Nossos resultados comprovam a heterogeneidade dos carcinomas mamários HER-2 positivos e indicam diferenças em pelos menos duas vias de sinalização celulares como possíveis explicações para as mesmas: a via PI3K/AKT e a androgênica / BACKGROUND: HER-2 positive carcinomas represent about 20-30% of all breast tumors and are characterized by a more aggressive clinical course with high cell proliferation and apoptosis resistance, determined by cascades of intracellular signals, such as the PI3K/AKT pathway. Trastuzumab, a humanized monoclonal antibody that binds to HER-2 molecule, is the standard treatment for these patients. The response to monotherapy with trastuzumab ranges from 12-30% and the persistence of activation of the PI3K/AKT pathway is one of mechanisms of resistance. Activation of AKT begins with the phosphorylation of PIP2 to PIP3 by PI3K. The dephosphorylation of PIP3 is mediated by PTEN and its deficiency is one of the factors possibly involved in resistance to trastuzumab. In addition to resistance to therapy, HER-2 positive tumors are heterogeneous in their biologic behavior. The search for different morphological and molecular patterns of carcinomas in this group aims to identify prognostic and predictive subgroups, allowing for customized therapy. OBJECTIVES: To study the immunohistochemical expression of two molecules of the signaling pathway PI3K/AKT (phosphorylated AKT and PTEN) and to explore the androgen signaling pathway through the expression of androgen receptor and apocrine morphological and molecular profiles. METHODS: This study retrospectively reviewed the histological preparations and built tissue microarray with tumor samples for immunohistochemical study. We assessed histologic type, apocrine morphology, presence of in situ component, histologic and nuclear grade, estrogen and progesterone receptors and proliferative activity through the immunohistochemical expression of Ki-67. The tissue preparations were examined for PTEN, phosphorylated AKT and androgen receptor. Patients, relatives and physicians were contacted for retrieval of follow-up data. RESULTS: We studied 104 primary breast cancer patients. The expression of PTEN was reduced in 20/104 (19.2%) cases and was more frequent in tumors with positive AKT (p = 0.06). The group of tumors without loss of PTEN expression showed higher proliferative activity. AKT was positive in 71/104 (68.3%) cases and was associated with a higher degree of differentiation and with expression of androgen receptor. The androgen receptor was positive in 89/104 (85.6%) cases and was associated with lower histological grade (p = 0.018), estrogen receptor (p = 0.008) and lower proliferative activity (p = 0.001). The absence of expression of estrogen receptor (apocrine molecular profile) was identified in 41/104 cases (39.4%) and was associated with tumors of higher histologic grade. The apocrine morphological profile was identified in 71 (68.3%) cases and was associated with high histological grade and nuclear. Follow-up was possible in 55 cases and a trend for shorter disease-free survival was observed in AKT-positive and AR-negative tumors. CONCLUSIONS: Our results confirmed that HER-2-positive breast cancers are heterogeneous and indicate that differences in at least two cellular signaling pathways PI3K/AKT and androgen pathway might underliy such a heterogeneity

The human Philadelphia chromosome (Ph) arises from a translocation between chromosomes 9 and 22 [t(9;22)(q34;q11)]. The resulting chimeric BCR-ABLoncogene encodes a constitutively activated, oncogenic tyrosine kinase that induces chronic myeloid leukemia (CML) and B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). The BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor (TKI), imatinib mesylate, induces a complete hematologic and cytogenetic response in the majority of CML patients, but is unable to completely eradicate BCR-ABL–expressing leukemic cells, suggesting that leukemia stem cells are not eliminated. Over time, patients frequently become drug resistant and develop progressive disease despite continued treatment. Two major reasons cause the imatinib resistance. The first one is the BCR-ABL kinase domain mutations which inhibit the interaction of BCR-ABL kinase domain with imatinib; the second one is the residual leukemia stem cells (LSCs) in the patients who are administrated with imatinib. To overcome these two major obstacles in CML treatment, new strategies need further investigation. As detailed in Chapter II, we evaluated the therapeutic effect of Hsp90 inhibition by using a novel water-soluble Hsp90 inhibitor, IPI-504, in our BCR-ABL retroviral transplantation mouse model. We found that BCR-ABL mutants relied more on the HSP90 function than WT BCR-ABL in CML. More interestingly, inhibition of HSP90 in CML leukemia stem cells with IPI-504 significantly decreases the survival and proliferation of CML leukemia stem cells in vitro and in vivo. Consistent with these findings, IPI-504 treatment achieved significant prolonged survival of CML and B-ALL mice. IPI-504 represents a novel therapeutic approach whereby inhibition of Hsp90 in CML patients and Ph+ ALL may significantly advance efforts to develop a cure for these diseases. The rationale underlying the use of IPI-504 for kinase inhibitor–resistant CML has implications for other cancers that display oncogene addiction to kinases that are Hsp90 client proteins. Although we proved that inhibition of Hsp90 could restrain LSCs in vitro and in vivo, it is still unclear how to define specific targets in LSCs and eradicate LSCs. In Chapter III, we took advantage of our CML mouse model and compared the global gene expression signature between normal HSCs and LSCs to identify the downregulation of Pten in CML LSCs. CML develops faster when Pten is deleted in Ptenfl/fl mice. On the other hand, Pten overexpression significantly delays the CML development and impairs leukemia stem cell function. mTOR is a major downstream of Pten-Akt pathway and it is always activated or overepxressed when Pten is mutated or deleted in human cancers. In our study, we found that inhibition of mTOR by rapamycin inhibited proliferation and induced apoptosis of LSCs. Notably, our study also confirmed a recent clinical report that Pten has been downregulated in human CML patient LSCs. In summary, our results proved the tumor suppressor role of Pten in CML mouse model. Although the mechanisms of Pten in leukemia stem cells still need further study, Pten and its downstream, such as Akt and mTOR, should be more attractive in LSCs study.