Escherichia coli produtoras de toxina de Shiga (STEC) são patógenos veiculados por alimentos capazes de causar desde diarréia branda até severa e sanguinolenta e evoluir para complicações graves como colite hemorrágica, síndrome hemolítica urêmica e púrpura trombótica trombocitopênica. Esses microrganismos têm sido associados a numerosos surtos e vários casos esporádicos de infecções em todo o mundo devido ao consumo de alimentos contaminados. O sorogrupo O157 desse grupo de microrganismos é considerado o principal devido ao seu envolvimento em surtos de doença por STEC, entretanto, muitos casos vêm ocorrendo em todo o mundo devido a cepas patogênicas de STEC não-O157, como O26, O103, O111 e O145. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a ocorrência de STEC em três pontos da linha de abate de bovinos destinados à exportação e em cortes refrigerados de aves e de bovinos comercializados na região da Grande São Paulo; pesquisar a presença dos fatores de virulência dos isolados através dos genes stx1, stx2, eaeA e ehxA; identificar isolados de E. coli O157:H7 pela pesquisa dos genes uidA, rfbO157 e flicH7; verificar a citotoxicidade em células Vero; pesquisar a atividade enterohemolítica dos isolados; avaliar o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos; identificar os sorotipos e avaliar a diversidade genética dos isolados de STEC obtidos. Na linha de abate, 201 animais foram amostrados, obtendo-se 603 amostras que compreenderam 201 amostras provenientes do couro, 201 de carcaça e 201 de meia carcaça. No varejo, foram analisadas 100 amostras de cortes de carne bovina e 100 de cortes de frango. A metodologia utilizada para detecção de E. coli sorogrupo O157 foi a preconizada pela ISO 16654, enquanto para os sorogrupos O26, O103, O111 e O145 foi empregada a metodologia descrita pelo \"Surveillance Group for Diseases and Infections of Animals\" (NRM 006). Os isolados obtidos foram confirmados como STEC pela técnica de PCR. Dos 201 animais amostrados, dois (1,0%) foram positivos para STEC, obtendo-se sete isolados (três do animal número 399 e quatro do animal 401) do couro. Não houve o isolamento do microrganismo nas amostras de carcaça e meia carcaça. Os sete isolados apresentaram o perfil stx2, uidA, eaeA, ehxA, rfbO157 e fliCH7 podendo, assim, ser considerados E. coli enterohemorrágica (EHEC) pertencentes ao sorotipo O157:H7. Na avaliação da atividade enterohemolítica, nenhum dos isolados expressou essa proteína e, com relação ao teste de suscetibilidade antimicrobiana, três (42,8%) isolados apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e um (14,3%) ao cloranfenicol. O PFGE revelou que as sete cepas de STEC isoladas apresentaram dois perfis genéticos distintos, com similaridade entre eles de 75,3%. STEC não foi detectada nas amostras de carne bovina e de aves comercializadas no varejo. Estes resultados sugerem que, apesar de presente no couro dos animais, o emprego de medidas sanitárias eficientes ao longo da cadeia de produção da carne bovina até sua comercialização na forma de corte, contribui para que o isolamento de STEC nas etapas posteriores seja raro. / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) are foodborne pathogens that can cause since mild or severe and bloody diarrhea to serious complications, such as hemorrhagic colitis, hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura. These microorganisms have been associated with numerous outbreaks and several sporadic cases worldwide due to consumption of contaminated food, especially meat. E. coli O157 is considered the main serogroup involved in disease outbreaks of STEC, however, many cases have been occurred worldwide due to non-O157, such as O26, O103, O111 and O145 strains. The aims of the present study were to determine the occurrence of STEC at three points of cattle slaughter for exporting and in refrigerated beef and poultry cuts commercialized in the Metropolitan area of Sao Paulo, Brazil; identify the genes that code for the virulence factors stx1, stx2, eaeA and ehxA; detect E. coli O157:H7 strains using uidA, rfbO157 and flicH7 genes; verify the citotoxicity in Vero cells and the enterohemolytic activity; evaluate the antimicrobial susceptibility profile; identify the STEC serotypes and evaluate the genetic diversity of STEC isolates. A total of 603 samples were collected from 201 animals at slaughter. The samples were taken from hide (201), carcass (201) and half-carcass (201) and were always collected from the breast region. At retail, 100 refrigerated beef cuts and 100 chicken cuts were analyzed. The detection of E. coli O157 samples were conducted according to the ISO methodology (16654) and for detection of O26, O103, O111 e O145 serogroups the Surveillance Group for Diseases and Infections of Animals methodology (NRM 006) was used. The isolates were confirmed as STEC by PCR technique. Among 201 animals sampled, two (1,0%) were positive for STEC, obtaining seven isolates from hide (three from animal number 399 and four from animal number 401). The microrganism was not detect in carcass and half carcass samples. The seven isolates carried stx2, uidA, eaeA, ehxA, rfbO157 and fliCH7 genes, so, they can be considered as enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7 serotype. None of the isolates produced the enterohemolytic activity and three (42,8%) isolates showed resistence to nalidixic acid and one (14,3%) to chloramphenicol. PFGE revealed that the seven STEC strains showed two distinct genetic profiles, with 75.3% of similarity between them. STEC was not detected from beef and poultry cuts commercialized at retail. These results suggest that, although present in animals hides, the STEC isolation at later stages of food chain was rare, probably due to effective sanitary measures to control contamination and transmission of this pathogen along the beef production chain until commercialization.

Escherichia coli produtoras de toxina de Shiga (STEC) são patógenos veiculados por alimentos capazes de causar desde diarréia branda até severa e sanguinolenta e evoluir para complicações graves como colite hemorrágica, síndrome hemolítica urêmica e púrpura trombótica trombocitopênica. Esses microrganismos têm sido associados a numerosos surtos e vários casos esporádicos de infecções em todo o mundo devido ao consumo de alimentos contaminados. O sorogrupo O157 desse grupo de microrganismos é considerado o principal devido ao seu envolvimento em surtos de doença por STEC, entretanto, muitos casos vêm ocorrendo em todo o mundo devido a cepas patogênicas de STEC não-O157, como O26, O103, O111 e O145. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a ocorrência de STEC em três pontos da linha de abate de bovinos destinados à exportação e em cortes refrigerados de aves e de bovinos comercializados na região da Grande São Paulo; pesquisar a presença dos fatores de virulência dos isolados através dos genes stx1, stx2, eaeA e ehxA; identificar isolados de E. coli O157:H7 pela pesquisa dos genes uidA, rfbO157 e flicH7; verificar a citotoxicidade em células Vero; pesquisar a atividade enterohemolítica dos isolados; avaliar o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos; identificar os sorotipos e avaliar a diversidade genética dos isolados de STEC obtidos. Na linha de abate, 201 animais foram amostrados, obtendo-se 603 amostras que compreenderam 201 amostras provenientes do couro, 201 de carcaça e 201 de meia carcaça. No varejo, foram analisadas 100 amostras de cortes de carne bovina e 100 de cortes de frango. A metodologia utilizada para detecção de E. coli sorogrupo O157 foi a preconizada pela ISO 16654, enquanto para os sorogrupos O26, O103, O111 e O145 foi empregada a metodologia descrita pelo \"Surveillance Group for Diseases and Infections of Animals\" (NRM 006). Os isolados obtidos foram confirmados como STEC pela técnica de PCR. Dos 201 animais amostrados, dois (1,0%) foram positivos para STEC, obtendo-se sete isolados (três do animal número 399 e quatro do animal 401) do couro. Não houve o isolamento do microrganismo nas amostras de carcaça e meia carcaça. Os sete isolados apresentaram o perfil stx2, uidA, eaeA, ehxA, rfbO157 e fliCH7 podendo, assim, ser considerados E. coli enterohemorrágica (EHEC) pertencentes ao sorotipo O157:H7. Na avaliação da atividade enterohemolítica, nenhum dos isolados expressou essa proteína e, com relação ao teste de suscetibilidade antimicrobiana, três (42,8%) isolados apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e um (14,3%) ao cloranfenicol. O PFGE revelou que as sete cepas de STEC isoladas apresentaram dois perfis genéticos distintos, com similaridade entre eles de 75,3%. STEC não foi detectada nas amostras de carne bovina e de aves comercializadas no varejo. Estes resultados sugerem que, apesar de presente no couro dos animais, o emprego de medidas sanitárias eficientes ao longo da cadeia de produção da carne bovina até sua comercialização na forma de corte, contribui para que o isolamento de STEC nas etapas posteriores seja raro. / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) are foodborne pathogens that can cause since mild or severe and bloody diarrhea to serious complications, such as hemorrhagic colitis, hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura. These microorganisms have been associated with numerous outbreaks and several sporadic cases worldwide due to consumption of contaminated food, especially meat. E. coli O157 is considered the main serogroup involved in disease outbreaks of STEC, however, many cases have been occurred worldwide due to non-O157, such as O26, O103, O111 and O145 strains. The aims of the present study were to determine the occurrence of STEC at three points of cattle slaughter for exporting and in refrigerated beef and poultry cuts commercialized in the Metropolitan area of Sao Paulo, Brazil; identify the genes that code for the virulence factors stx1, stx2, eaeA and ehxA; detect E. coli O157:H7 strains using uidA, rfbO157 and flicH7 genes; verify the citotoxicity in Vero cells and the enterohemolytic activity; evaluate the antimicrobial susceptibility profile; identify the STEC serotypes and evaluate the genetic diversity of STEC isolates. A total of 603 samples were collected from 201 animals at slaughter. The samples were taken from hide (201), carcass (201) and half-carcass (201) and were always collected from the breast region. At retail, 100 refrigerated beef cuts and 100 chicken cuts were analyzed. The detection of E. coli O157 samples were conducted according to the ISO methodology (16654) and for detection of O26, O103, O111 e O145 serogroups the Surveillance Group for Diseases and Infections of Animals methodology (NRM 006) was used. The isolates were confirmed as STEC by PCR technique. Among 201 animals sampled, two (1,0%) were positive for STEC, obtaining seven isolates from hide (three from animal number 399 and four from animal number 401). The microrganism was not detect in carcass and half carcass samples. The seven isolates carried stx2, uidA, eaeA, ehxA, rfbO157 and fliCH7 genes, so, they can be considered as enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7 serotype. None of the isolates produced the enterohemolytic activity and three (42,8%) isolates showed resistence to nalidixic acid and one (14,3%) to chloramphenicol. PFGE revealed that the seven STEC strains showed two distinct genetic profiles, with 75.3% of similarity between them. STEC was not detected from beef and poultry cuts commercialized at retail. These results suggest that, although present in animals hides, the STEC isolation at later stages of food chain was rare, probably due to effective sanitary measures to control contamination and transmission of this pathogen along the beef production chain until commercialization.

La détection et l’identification de micro-organismes pathogènes est un réel enjeu de santé public tant au niveau alimentaire, que clinique ou d’intérêt national tel qu’illustré en biodéfense. Dans tous ces domaines, il est important d‘avoir des méthodes d’identification et de détection qui soient à la fois rapide, sensible et robuste. Cette thèse a pour objectif de contribuer au développement d’une approche rapide d’identification de micro-organismes sans a priori par spectrométrie de masse en tandem. Cette approche innovante, appelée phylopeptidomique, repose sur l’alliance de la peptidomique, i.e. analyse à large échelle des peptides provenant de la digestion enzymatique d’un échantillon biologique, et de la phylogénie des organismes cellulaires. Après extraction des protéines présentes dans l’échantillon à ausculter, des peptides sont générés et analysés par spectrométrie de masse en tandem. La déconvolution des signaux MS/MS à l’aide du logiciel « µOrg.ID » développé en propre au laboratoire permet d’identifier et quantifier les organismes présents dans l’échantillon en fonction des organismes indexés dans les bases de données. L’étude du protéome de Bacillus atrophaeus, agent simulant de l’anthrax, sous forme sporulée et végétative a permis d’illustrer une méthode d’identification de biomarqueurs protéiques permettant de déterminer le ratio entre les deux formes dans un échantillon. La limite de détection de la phylopeptidomique dans des échantillons purs et des échantillons en mélange équimolaire a été établie sur des bactéries modèles d’intérêts médical et environnemental. La limite de détection de spores de Bacillus atrophaeus en présence de 14 matrices interférentes (alimentaires, environnementales et autres) a permis de mettre en évidence les avantages et limitations de l’approche. Enfin, un mélange artificiel standardisé de 24 organismes a été développé afin d’évaluer les outils de bio-informatique en métaprotéomique. / The detection and identification of pathogenic microorganisms is a real public health issue for the food industry and the clinics or national interest as illustrated in the biodefense field. Thus, it is important to have identification and detection methods that are fast, sensitive and robust. This PhD thesis aims at contributing to the development of a rapid approach to identify microorganisms without any a priori by tandem mass spectrometry. This innovative approach, called phylopeptidomics, is based on the combination of peptidomics, i.e. large scale analysis of peptides derived from the enzymatic digestion of a biological sample, and the phylogeny of cellular organisms. After extraction of the proteins from the sample of interest, peptides are generated and analyzed by tandem mass spectrometry. The deconvolution of MS/MS signals using the "μOrg.ID" software developed in the laboratory enables the identification and quantification of organisms present in the sample according to the organisms indexed in generalist databases. The study of the proteome of Bacillus atrophaeus, a simulant agent of anthrax, in sporulated and vegetative form, has provided an illustration of a new method of identification of protein biomarkers, which allows determining the ratio between both forms. The limit of detection of phylopeptidomics in pure samples and equimolar mixtures was established with model bacteria of medical and environmental interests. The limit of detection of B. atrophaeus spores in the presence of 14 interfering matrices (food, environmental and others) has highlighted the advantages and limitations of the approach. Finally, a standardized artificial mixture of 24 organisms was developed in order to evaluate bioinformatics tools in metaproteomics.