Parmi leurs applications prometteuses, les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) présentent un potentiel inestimable pour améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application de modélisation pathologique est devenue possible grâce à l’utilisation de lignées hES porteuses de la mutation causale d’une maladie monogénique, obtenues au cours d’un diagnostique pré-implantatoire. L’équipe dans laquelle j’ai effectué mes travaux de thèse a démontré que des lignées hES et leurs progénies, porteuses de la mutation causale de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), exprimaient des défauts moléculaires caractéristiques de la pathologie, permettant ainsi leur analyse de façon plus pertinente par rapport à des cultures primaires dérivées de biopsies de patients et validant l’utilisation de ce modèle cellulaire. Dans ce contexte, dans la première partie de mon travail de thèse, mon objectif a été de mettre au point des conditions de culture permettant la différenciation des cellules hES normales et mutantes vers le lignage neural afin d’obtenir des populations homogènes de progéniteurs neuraux et de cellules souches neurales, puis de les caractériser sur le plan phénotypique et fonctionnel. Par une étude transcriptomique, j’ai ensuite comparé le profil d’expression de ces progéniteurs neuraux à une autre population homogène de précurseurs mésenchymateux. J’ai ainsi identifié des gènes et des voies de signalisation spécifiques à chacune de ces populations. (Article 1). Dans la seconde partie de mes travaux, ma contribution au projet de modélisation pathologique de DM1 a été d’utiliser ces progéniteurs neuraux et les cellules souches neurales mutés pour explorer les mécanismes physiopathologiques responsables des symptômes neurologiques observés dans cette pathologie. J’ai ainsi identifié une anomalie dans une voie de signalisation cellulaire perturbée, la voie la voie mTORC1, basée sur l’observation selon laquelle les cellules NSC porteuses de la mutation DM1 proliféraient plus lentement que les cellules contrôles (Article II). J’ai également étudié l’expression la protéine Tau, connue pour son implication dans la maladie d’Alzheimer, et mis en évidence des modifications suggérant une altération du transport axonal dans les neurones issus des lignées hES mutantes. Ces résultats, associés à ceux réalisés dans l’équipe, permettent d’apporter la preuve de concept de l’intérêt d’un tel modèle cellulaire pour la modélisation pathologique des maladies monogéniques. / Among their promising applications, human embryonic stem cells lines (hES) have huge potential to improve the understanding of molecular and cellular mechanisms involved in the development of monogenic diseases. This application of modeling pathologic became possible using hES cell lines carrying the causal mutation of a monogenic disease, obtained during pre-implantation diagnosis. The team where I did my thesis work demonstrated that hES cell lines and their progeny, carrying the causal mutation in myotonic dystrophy type 1 (DM1), expressing the molecular defects characteristic of the pathology, allowing more relevant analysis than primary cultures derived from biopsies of patients and validates the use of this cell model. In this context, in the first part of my thesis, my goal was to develop culture conditions for hES cell differentiation into normal and mutant neural lineage in order to obtain homogeneous populations of neural progenitors and neural stem cells and to characterize their phenotypic and fonctional preperties. Next, using a transcriptomic method, I compared the expression profile of neural progenitors to another homogeneous population of mesenchymal precursors. Thus, I identified genes and signaling pathways specific to each of these populations. (Article 1). In the second part of my work, my contribution to the pathological modeling of DM1 was to use these mutant neural progenitor cells and neural stem cells to explore the pathophysiological mechanisms involved in neurological symptoms observed in this pathology. Thus, I have identified a cell signaling pathway defects in mTORC1 pathway based on the observation that NSC cells carrying DM1 mutation proliferated more slowly than control cells (Article II).At last, I also studied the expression of Tau protein, a protein involved in Alzheimer’s disease and I have highlighted changes suggesting impairement of axonal transport in neurons derived from hES cell lines mutant. These results, together with those performed in the team, can provide proof of concept for the benefit of such a cell model for modeling disease monogenic diseases.

Ces travaux visaient à établir un protocole permettant de différencier des cellules pluripotentes (embryonnaires ou induites) en kératinocytes capables de générer un épiderme pluristratifié in vitro et in vivo pour la thérapie cellulaire et la modélisation pathologique. Dans une 1ère partie, des cellules hES ont été utilisées pour être différenciées en culture en kératinocytes. Ces cellules ont été caractérisées par des approches de RT-PCR quantitative, FACS et d’immunofluorescence. De plus, leur potentiel immunogène a été évalué par l’analyse en FACS des protéines du CMH de classe I et II. La capacité de ces kératinocytes à reformer un épiderme stratifié a été démontrée in vitro,sur une matrice synthétique, mais aussi in vivo après greffe sur souris immunodéficientes. Dans une 2ème partie, des cellules hIPS ont ensuite été dérivées en kératinocytes avec le même protocole. Si la caractérisation des kératinocytes issus des hIPS a produit des résultats positifs, la possibilité de maintenir ces cellules en culture s’est révélée impossible dans les conditions utilisées. De même, alors que la stratégie visait à modéliser les épidermolyses bulleuses, l’interférence avec l’expression de protéines impliquées dans la jonction épidermo-dermique n’a pas été couronnée de succès. Par contre, des nouvelles hIPS mutées ont pu être générées puis différenciées en kératinocytes, prouvant ainsi la possibilité d’utiliser cette démarche pour modéliser la pathologie. Dans une 3ème partie, une étude d’expression différentielle a permis de démontrer que les kératinocytes dérivés des cellules pluripotentes surexpriment la kératine 19 (marqueur foetal) par rapport à des kératinocytes postnataux. / This work aimed to establish a protocol for the differention of pluripotent cells (embryonic or induced) into keratinocytes, which must be able to generate a pluristratified epidermis in vitro as well as in vivo for cell therapy and pathological modeling. In the 1st part of this work, a new protocol was developped to derive keratinocytes from hES cells. These cells were characterized by using RTq-PCR, FACS and immunofluorescence assays. Their immunogenicity was also evaluated by FACS analysis of class I and class II MHC proteins. The capacity of these keratinocytes to generate a pluristratified epidermis has been proved in vitro as well as in vivo following grafts onto immunodeficient mice. In a 2nd part of this work, hIPS cells were then derived into keratinocytes using the same protocol. The characterization of heratinocytes derived from hIPS produced positive results, but it was unfortunately not possible to maintain those cells in culture. Similarly, a strategy based on RNA interference against dermoepidermal junction proteins was not successful; but new hIPS mutated cell lines have been established and differentiated into keratinocytes, proving the feasibility of such an approach for pathological modeling. In a 3rd part of this work, a differential expression study proved that keratinocytes derived from pluripotent cells overexpress keratin 19 (marker fetus) when compared with postnatal keratinocytes.