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Produção em biorreator de um peptídeo antimicrobiano com o uso do marcador ELP-Inteína

Sousa, Daniel Amaro 12 September 2016 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-30T15:01:10Z No. of bitstreams: 1 2016_DanielAmaroSousa.pdf: 4401658 bytes, checksum: b3a650245da825ef86db8e24d979983a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-13T18:58:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DanielAmaroSousa.pdf: 4401658 bytes, checksum: b3a650245da825ef86db8e24d979983a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T18:58:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DanielAmaroSousa.pdf: 4401658 bytes, checksum: b3a650245da825ef86db8e24d979983a (MD5) / Um dos mais importantes aspectos relacionados aos patógenos infecciosos pode ser relacionado à sua excepcional adaptabilidade para o desenvolvimento de resistência, o que leva a um desafio de descoberta de novas drogas antimicrobianas, com novos mecanismos de ação. Entre estes, os peptídeos antimicrobianos (PAMs) se apresentam como promissoras moléculas anti-infectivas. Buscando superar os altos custos associados com o isoladamente a partir de fontes naturais ou da síntese química de PAMs, propõem-se no presente trabalho a expressão do Pa-MAP 2, um PAM rico em alaninas. Para isso, este peptídeo foi fusionado a um marcador ELP-inteína, onde o ELP foi usado para promover a auto-agregação, possibilitando um isolamento rápido e de baixo custo. A inteína foi usada para permitir a liberação controlada do peptídeo. Para isso, o vetor pET 21a foi usado para produzir o Pa-MAP 2 fusionado a região N-terminal da inteína modificada Mxe GyrA, seguido por um ELP de 60 repetições. Após purificação, o Pa-MAP 2 demonstrou MIC contra E. coli ATCC 8739 de 25 μM. A análise do cultivo em biorreator demonstrou que o Pa-MAP 2 pode ser produzido tanto em meio rico quanto em meio definido, com rendimento 50 vezes superior que o reportado para outros peptídeos produzidos pelo sistema ELP-inteína, e em rendimentos comparáveis a sistemas de expressão com clivagem química ou proteases. Desta forma, a metodologia do presente trabalho contribui para aplicação biotecnológica dos PAMs. Os resultados aqui apresentados demonstram uma comparação de diferentes condições de cultivo, para obter alto rendimento do Pa-MAP 2, usando o sistema ELP-inteína, contribuindo para incluir os PAMs como futuras alternativas aos antimicrobianos convencionais. / One of the most important aspects related to infectious pathogens may be correlated to an exceptional adaptability in developing resistance, which leads to a challenge in the discovery of antimicrobial drugs with novel mechanisms of action. Among them, antimicrobial peptides (AMPs) stand out as promising anti-infective molecules. In order to overcome the high costs associated with isolation from natural sources or chemical synthesis of AMPs we propose the expression of Pa-MAP 2, a polyalanine AMP. Pa-MAP 2 was fused to an ELP-intein tag where the ELP was used to promote aggregation and fast and cost-effective isolation after expression, and the intein was used to stimulate a controlled AMP release. For these, the vector pET21a was used to produce Pa-MAP 2 fused to the N-termini region of a modified Mxe GyrA intein followed by 60 repetitions of ELP. Purified Pa-MAP 2 showed a MIC of 25 μM against E. coli ATCC 8739. Batch fermentation demonstrated that Pa-MAP 2 can be produced in both rich and defined media at yields 50-fold higher than reported for other AMPs produced by the ELP-intein system, and in comparable yields to expression systems with protease or chemical cleavage. Therefore, the methodology applied here contributes to the biotechnological application of AMPs. Our results show a comparison of different fermentation conditions to obtain high yields of Pa-MAP 2 using the ELP-intein system, contributing to including these molecules as future alternatives to conventional antibiotics in the pharmaceutical field.
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História evolutiva do HIV-1 no Brasil

Véras, Nazle Mendonça Collaço 31 May 2010 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T15:17:05Z No. of bitstreams: 2 2010_NazleMendoncaCollacoVerasSegundaParte.pdf: 17461857 bytes, checksum: 92c83ffee5e8c3178065ee8b9fcc135d (MD5) 2010_NazleMendoncaCollacoVerasParte1.pdf: 22584531 bytes, checksum: 28669e38ce266f342b24224d209a8f43 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T15:39:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2010_NazleMendoncaCollacoVerasSegundaParte.pdf: 17461857 bytes, checksum: 92c83ffee5e8c3178065ee8b9fcc135d (MD5) 2010_NazleMendoncaCollacoVerasParte1.pdf: 22584531 bytes, checksum: 28669e38ce266f342b24224d209a8f43 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-17T15:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2010_NazleMendoncaCollacoVerasSegundaParte.pdf: 17461857 bytes, checksum: 92c83ffee5e8c3178065ee8b9fcc135d (MD5) 2010_NazleMendoncaCollacoVerasParte1.pdf: 22584531 bytes, checksum: 28669e38ce266f342b24224d209a8f43 (MD5) / A caracterização dos diferentes subtipos do HIV-1 prevalentes em uma região geográfica, assim como a compreensão da origem e disseminação desses subtipos, é essencial para definir estratégias de prevenção e intervenção nas epidemias locais de HIV/AIDS. O presente trabalho analisou 895 seqüências de pol disponíveis no GenBank, visando descrever os principais subtipos do HIV-1 prevalentes no Brasil, o perfil de resistência de linhagens não expostas a anti-retrovirais, a prevalência de assinaturas e epitopos na protease e transcripatse reversa (RT) e reconstruir a origem e os principais padrões de disseminação dos subtipos B e C do HIV-1 no Brasil. O subtipo B (65,6%) foi o mais prevalente, seguido dos subtipos C (14,1%) e F (6,1%). As formas recombinantes representaram 14,1% das seqüências analisadas. Foram encontradas oito mutações primárias na protease que diminuem a susceptibilidade aos inibidores de protease (PI): L24I, D30N, M46I/L, I54L/V, V82L e I84V. Na RT, foram identificadas 16 mutações associada a resistência aos inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (NRTI), A62V, D67N/G, T69E/N/S/d, K70R, V75I/L/M, F77L, V118I, Q151M e M184V, e 18 que conferem resistência aos inibidores de transcriptase reversa não-análogos de nucleosídeos (NNRTI), V90I, A98G, L100I, K101E/N/Q, K103N/R, V106I/L, V108I, E138A/G/K, V179D/T, Y181C e G190A. A transmissão de linhagens resistentes aos PI, NRTI e NNRTI foi de 1,2%, 1,8% e 2,1%, respectivamente. Quanto à variabilidade genética de pol, foram identificadas duas possíveis assinaturas, N37K e R41N, na protease de linhagens do subtipo C do HIV-1, dois epitopos reconhecidos por células T CD4+ na protease e 18 por células T CD8+, sendo cinco na protease e 13 na RT. Desses últimos, KLVDFRELNK, GIPHPAGLK, TVLDVGDAY, NETPGIRYQY, IRYQYNVL e VIYQYMDDL, são altamente recomendados para a produção de protótipos vacinais a serem aplicados no Brasil. A entrada do subtipo B do HIV-1 no Brasil ocorreu no início da década de 70, pelo Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul, a partir dos quais as linhagens se dispersaram exponencialmente em direção a outros estados do Nordeste e Centro-Oeste do país. O subtipo C, por sua vez, entrou no Paraná, em meado da década de 70, e, logo após sua introdução, disseminou exponencialmente no Sul do país. A aplicação de análises fillogenéticas de alta resolução, análises de coalescência e filogeografia permitiu a caracterização da epidemia do HIV-1 no Brasil, a re-avaliação de hipóteses e a formulação de novas teorias sobre a origem e disseminação dos subtipos B e C no país. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Characterizing the different HIV-1 subtypes prevalent in a geographic region as well as understanding the origin and dissemination of these subtypes are essential to define prevention and intervention strategies targeting local HIV/AIDS epidemics. The present study analyzed 895 pol sequences, available at GenBank, aiming to describe the main HIV-1 subtypes prevalent in Brazil, the resistance profile of naïve lineages, the prevalence of signatures and epitopes in protease and reverse transcriptase (RT), and reconstruct the origin and the main dissemination patterns of HIV-1 subtypes B and C in Brazil. The subtype B (65.6%) was the most prevalent followed by subtypes C (14.1%) and F (6.1%). The recombinant forms represented 14.1% of the analyzed sequences. At protease, eight major mutations which reduce the susceptibility to protease inhibitors (PIs) were found: L24I, D30N, M46I/L, I54L/V, V82L and I84V. At RT, 16 mutations associated to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) resistance, A62V, D67N/G, T69E/N/S/d, K70R, V75I/L/M, F77L, V118I, Q151M and M184V, and 18 mutations that confer resistance to the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs), V90I, A98G, L100I, K101E/N/Q, K103N/R, V106I/L, V108I, E138A/G/K, V179D/T, Y181C and G190A, were identified. The transmission of lineages resistant to PIs, NRTIs and NNRTIs were 1.2%, 1.8% and 2.1%, respectively. Regarding pol genetic variability, we identified two possible signatures, N37K e R41N, at HIV-1 subtype C protease, two T CD4+ epitopes and 18 T CD8+ epitopes, of which five were at protease and 13 at RT. Concerning these last ones, KLVDFRELNK, GIPHPAGLK, TVLDVGDAY, NETPGIRYQY, IRYQYNVL and VIYQYMDDL are highly recommended to the production of vaccine prototypes to be applied in Brazil. The HIV- 1 subtype B introduction in Brazil occurred in the beginning of 1970s, through Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul, from where the lineages exponentially spread to Northeastern and Central Brazil. The subtype C, in turn, entered in Paraná, during mid- 1970s, and, briefly after its introduction, started to spread exponentially in the South region. The application of high-resolution phylogenetics, coalescent analysis and phylogeography, allowed an in-depth characterization of the HIV-1 epidemic in Brazil, the reevaluation of hypothesis and the formulation of new insights about the origin and dissemination of subtypes B and C in the country.

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