La peau humaine est un matériau biologique complexe. Elle est constituée de trois couches d'épaisseurs très différentes : épiderme, derme et hypoderme. Cette complexité structurale donne à la peau des propriétés mécaniques complexes : hyperélastique, nonlinéaire, viscoélastique et soumises à la pré-tension. Un dispositif d'indentation composé de 6 niveaux de chargement et fonctionnant dans l'environnement de l'IRM a été développé. Des tests d'indentation ont été effectués sur la partie dorsale de l'avant-bras gauche de 9 sujets d'âges variant de 26 à 40 ans. Pour chaque sujet, 28 images issues de l'IRM ont été construites. Chaque image représente une coupe de l'avant-bras. Les images ont été ensuite traitées via un logiciel de traitement d'images médicales développé en interne afin de segmenter les couches cutanées, les muscles et les os. Enfin, un modèle des éléments finis en 2D a été construit à partir des images IRM à la configuration initiale (sans charge) grâce à un pré-post processeur MSC.Patran 2005. Ce modèle est constitué de 4 couches de matériaux différents : trois couches cutanées et une couche de muscles. Les os étaient supposés rigides et fixes. La loi de comportement hyperélastique incompressible de type de Néo-Hooke avec un seul paramètre à identifier C10 a été utilisée pour toutes les 4 couches de matériaux (C10,Epi., C10,Der., C10,Hyp., C10,Mus.). Les tests d'indentation ont été simulés en utilisant un solveur MSC.Marc 2005. L'erreur entre les résultats de la simulation et ceux de l'expérimentation a été mesurée par une fonction objective. L'identification des paramètres de la loi de comportement a été réalisée par la minimisation de la fonction objective via un algorithme de Levenberg-Marquardt développé sous l'environnement MatLab. La validation numérique du processus d'identification a montré que le minimum est unique dans le cas où les deux premières couches (épiderme et derme) se comportent comme une seule couche (C10,E+D). Les résultats d'identification donne une gamme des valeurs pour une population de 9 sujets : C10,E+D = [60-370] kPa; C10,Hyp. = [0,04-4] kPa; C10,Mus. = [0,7-1,7] kPa. Ces résultats montrent la variabilité humaine des propriétés mécaniques.

Le vieillissement de la peau et l'exposition cumulative aux UVs au sein d'une vie affecte un certain nombre d'acteurs de la matrice extracellulaire, majoritairement le collagène, l'élastine, les glycanes et les biomolécules qui leurs sont associés (métalloprotéinases et leurs inhibiteurs, hyaluronidases, etc...) qui peuvent être modifiés en terme de concentration, de structure et/ou de répartition. L'organisation hydrique est également perturbée lors de ce phénomène et l'ensemble de ces modifications aboutit à une perte de fonction de la matrice et à l'apparition de manifestations cliniques du vieillissement. L'objectif de ce travail de thèse effectuée en partenariat avec le Centre de Recherche sur la peau (Pierre Fabre Dermo-Cosmétique) est d'analyser les modifications du derme et de l'organisation hydrique au sein de la matrice, avec l'âge et sous l'effet des UVs, de façon à mieux comprendre les altérations de la peau dans ces conditions. Compte tenu des différentes échelles à explorer - de l'Angstrom au micron -, la combinaison d'un ensemble de techniques est nécessaire pour disposer de lois de comportement de dynamique macromoléculaire qui permettent l'interprétation des résultats. Nous avons tout d'abord validé l'utilisation de la spectroscopie infra-rouge (IRTF), de l'analyse calorimétrique diatherme (ACD) et de la technique des courants thermostimulés (CTS) pour analyser des biopsies cutanées humaines. Ces techniques se sont révélées adaptées pour sonder le derme sur une large gamme d'échelle, et pour apporter des informations pertinentes sur les principales macromolécules du derme et sur son organisation hydrique. Nous avons ensuite suivi l'évolution des réponses thermiques, diélectriques et vibrationnelles du derme au cours du vieillissement chronologique et du photo-vieillissement via une étude clinique portant sur des sujets de deux groupes d'âge (20-30 ans et supérieur à 60 ans). Ce travail a permis d'extraire des marqueurs du vieillissement intrinsèque et extrinsèque. L'évolution de ces réponses a aussi été suivie dans une étude ex vivo portant sur les effets de l'exposition du derme aux UVs, afin de contribuer à la compréhension des différents mécanismes mis en jeu lors du vieillissement chronologique et du photo-vieillissement. / Skin aging and cumulative exposure to UVs within a lifetime affects a number of actors in the extracellular matrix such as collagen, elastin, glycans and associated biomolecules (metalloproteinases and their inhibitors, hyaluronidases, etc). The concentration, structure and / or distribution, and the hydric organization are modified by this phenomenon. All these modifications result in a loss of function of the matrix and the clinical manifestations of aging. The aim of this thesis, carried out in collaboration with the Skin Research Center of Pierre Fabre Dermo-Cosmétique, is to analyze the changes in the dermis and the hydric organization within the matrix with age and under the effect of UVs to help the knowledge of skin alteration under these conditions. Given the different scales to be explored - from Angstrom to the micron - a combination of different techniques is necessary to reach the macromolecular dynamics via behavior laws. Firstly, we validated the use of infrared spectroscopy (FTIR), differential scanning calorimetry (DSC) and thermostimulated Currents (TSC) techniques to analyze human cutaneous biopsies. These techniques were proven to be suitable to scan the dermis over a wide range of scales and to provide relevant information on the main macromolecules of the dermis and the different water structures. Then we studied the evolution of thermal, dielectric and vibrational signatures of the dermis during chronological aging and photo-aging via a clinical study involving subjects from two age groups (20-30 years and over 60 years). Markers of intrinsic and extrinsic aging have been extracted from this work. The evolution of these signatures was also studied in an ex vivo study on the effects of UV exposure of dermis, leading to a better understanding of the different mechanisms involved in chronological aging and photo-aging.

La connaissance des propriétés mécaniques de la peau humaine in vivo est d’une importance capitale dans de nombreux domaines (médical, cosmétique…). L’objectif de cette thèse est de développer de nouveaux outils pour permettre d’une part au clinicien de caractériser de manière objective les propriétés mécaniques de la peau, et d’autre part d’améliorer la compréhension générale du comportement de cet organe avec le vieillissement. Le premier chapitre est une revue bibliographique de la physiologie et des propriétés physiques de la peau ainsi que des différents moyens d’investigations actuels de ses propriétés. A partir de cette revue, deux axes de recherche sont définis, un axe de sollicitation tangentielle et un axe de sollicitation normale au tissu. Le second chapitre s’intéresse au premier axe de recherche, avec le développement d’une méthode d’indentation dynamique et d’une méthode d’indentation sans contact. Une baisse du module d’Young est trouvée avec l’âge. Le troisième chapitre s’intéresse à l’axe de sollicitation tangentielle, avec une méthode d’extension compression couplant mesures d’efforts et mesures des champs de déplacements de la zone sollicitée. Une approche inverse par un modèle Éléments Finis avec une loi de comportement orthotrope montre à partir des essais réalisés une baisse globale des propriétés mécaniques de la peau avec l’âge. Le quatrième et dernier chapitre relie les deux approches (normale et tangentielle) en comparant les résultats obtenus et tire les perspectives de ces travaux. / The knowledge of the mechanical properties of human skin in vivo is essential for many domains (medical, clinical…). The aim of this thesis is to develop new devices for the clinician in order to perform objective assessment of the mechanical properties of human skin, and also to improve the understanding of the whole mechanical behaviour of this organ with ageing.The first chapter is a bibliography concerning the physiology and the physical properties of the skin and also an overview of the actual devices used for the assessment of these properties. Based on this review, two different ways of stress have been chosen, a normal stress axis and a tangential stress axis to the skin.The second chapter concerns the first way of stress, with the development of a dynamic indentation method and a non contact method. A decrease of the Young modulus is found with ageing.The third chapter concerns a tangential axis of stress, with an extension-compression test using force measurement combined to displacement field measurement of the stressed area. An inverse method using a Finite Element model with an orthotropic law shows that results obtained give a decrease of the mechanical properties of the skin with ageing.The fourth and last chapter links the two different way of stress used with a comparison of results obtained and gives some perspectives of this work.

Les cellules T spécifiques d'antigène dans la peau participent au contrôle des infections cutanées. Toutefois, leurs mécanismes d'induction après infection ou vaccination ainsi que leur rôle dans la protection et leur maintenance restent à étudier. Nous avons émis l'hypothèse que l'infection cutanée ou la vaccination cutanée pouvaient programmer une réponse cellulaire T spécifique d'antigène cutanée. Notre premier objectif était le développement de modèle d'étude de la peau humaine, des cellules T cutanées et de la vaccination par la peau. Un modèle de greffes de peau humaine à des souris immunodéficientes, a permis de montrer un maintien et la fonctionnalité des cellules présentatrices d'antigènes et cellules T cutanées plusieurs semaines après greffe. J'ai ainsi mis en place un modèle d'étude in vivo des cellules humaines cutanées.Dans un deuxième temps, un essai clinique randomisé chez le volontaire sain, a étudié l'impact de la voie d'administration - intradermique, transcutanée ou intramusculaire - du vaccin antigrippal sur les réponses immunitaires. Cette étude de longue durée et multiparamétrique n'étant pas terminée, nous aborderons les résultats de l'impact de l'inflammation, en particulier CXCL-10, dans l'induction des réponses adaptatives.Enfin, le rôle des lymphocytes T cutanés dans la protection contre les herpesvirus - VZV, HSV-1, HSV-2 - restant méconnus et notamment la potentielle réactivité croisée des cellules T cutanées contre ces 3 virus, j'ai mis en place un modèle murin préclinique permettant d'étudier les réponses T spécifiques cutanées et systémiques à la varicelle après vaccination. Une étude clinique est maintenant en cours de montage. En conclusion, au cours de mon doctorat, j’ai pu mettre en évidence l’importance des LT cutanés notamment mémoires dans la mise en place de la réponse immunitaire après vaccination et/ou infection. Ces données sont importantes pour l’amélioration des stratégies vaccinales. / Antigen -specific T cells in the skin represents a considerable advantage. It has been proposed that these cells may participate in the control of skin infections. However, further investigation is needed to understand their mechanism of induction after infection or vaccination, their maintenance in the skin tissue and their role in the protection upon re-infection. We hypothesized that the skin vaccination or infection can program a cutaneous population of antigen-specific T cell response. In order to study T cell populations in the skin, we set up different in vivo and clinical models of study of human skin T cells. A model of human skin grafts in immunodeficient mice, allowed us to show the persistance of antigen-presenting cells as well as antigen-specific effector T skin cells in human skin engrafted explants. We have demonstrated their functionality several weeks after skin transplantation. This study provides an in vivo model for studying in vivo human skin T cells upon infection or vaccination. In a second part, we performed a randomized clinical trial of healthy volunteers, to study the impact of routes of immunization using trivalent-influenza vaccine (TIV) by intradermal, transcutaneous (hair follicular targeting) or intramuscular routes on immune responses. This long-term study is not completed yet. However, we will discuss the first results of the impact of inflammation including cytokine, CXCL10 on vaccination local side effects and in the induction of adaptive responses. In a third part, we asked the role of T lymphocytes in human skin infections or mucous membranes against herpèsviruses (VZV, HSV-1, and HSV-2). We hypothesized cross-reactive T cell skin against these three viruses. A preclinical mouse model for studying cutaneous and systemic T cell specific responses to varicella after vaccination has been developed. A clinical study is in progress.

D’un point de vue mécanique, la peau est une structure multicouche complexeayant des propriétés viscoélastique, non-linéaire, quasi-incompressible, anisotrope eten état de précontrainte. Le travail présenté dans cette thèse associe expérimentation,modélisation et identification numérique et se distingue en particulier parl’utilisation d’un dispositif d’extensométrie développé au laboratoire et adapté à desmesures in vivo non invasives. Des tests ex vivo ont cependant été réalisés égalementà titre de comparaison et de validation. Une attention particulière a été portée à latension cutanée initiale (ou naturelle). Les essais in vivo ont permis d’obtenir desréponses force – déplacement sous différentes configurations angulaires, d’intensitéet pour diverses localisations corporelles. Les essais ex vivo ont quant à eux permisd’estimer l’état de contrainte initiale par la mesure des forces nécessaires à la remiseen tension d’explants. Ces différents essais expérimentaux ont été modélisés en utilisantdeux lois de comportement : la loi d’Ogden du premier ordre permettant dedécrire un comportement hyperélastique isotrope et la loi d’Holzapfel-Gasser-Ogden(HGO) décrivant un comportement hyper élastique anisotrope. Cette dernière a étéimplémentée sous l’interface utilisateur du logiciel ANSYS. Les paramètres caractéristiquesdes zones cutanées testées ont été identifiés par méthode inverse. L’influencede la compressibilité de la peau sur son comportement mécanique est mise en évidence.Au final, les travaux de cette thèse ont été appliqués au lambeau d’avancementde type V-Y qui est une technique de suture pratiquée pour combler les pertes desubstance.229 / From a mechanical point of view, the human skin is a complex multilayerstructure with viscoelastic, non-linear and anisotropic properties and a pre-stressstate. The work presented in this thesis combines experimentation, modeling andnumerical identification and distinguishes especially by the use of an extensometerdevice developed in the laboratory and suitable for non-invasive in vivo measurements.Ex vivo tests were however also performed for comparison and validation.Particular attention was paid to the initial skin tension. in vivo tests allowed theobtaining of load – displacement responses for different angular configurations, intensitiesand body locations. ex vivo tests in turn allowed the estimation of the stateof initial stress by measuring the forces necessary for the re-tension of the explants.These different experimental tests were modeled using two constitutive laws : thefirst order Ogden law allowing the description of an isotropic hyperelastic behavior,and the Holzapfel-Gasser-Ogden’ law (HGO) allowing the description of an anisotropichyperelastic behavior. The latter was implemented in the user interface ofANSYS software. The characteristics parameters of the skin areas tested were identifiedby the reverse method. The influence of the compressibility of the skin on itsmechanical behavior is highlighted. Finally, the work of this thesis were applied toan advancement flap of V-Y type.

La richesse de la peau en cellules présentatrices d'antigènes fait de ce tissu un site prometteur pour la vaccination. Des différences dans les réponses humorales et cellulaires induites par voie transcutanée et intradermique, en comparaison des voies conventionnelles, sont observées in vivo chez l'Homme. Ces observations mettent en évidence la mauvaise compréhension des mécanismes immunitaires induits dans la peau. Un modèle ex vivo d'explant de peau humaine nous a permis d'étudier les évènements précoces de l'immunité innée induits suite à l'administration d'un antigène par voie cutanée. Nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme induit en réponse à une stimulation par des agonistes de TLRs. Nous montrons que la production de la cytokine IL- 32 par les kératinocytes contribue à l'activation des cellules de Langerhans. Une analyse protéomique des modifications induites dans le micro-environnement cutané, suite à l'administration intradermique d'un vaccin Influenza, nous a permis d'établir une signature de la réponse inflammatoire cutanée. Nous observons l'expression de protéines impliquées dans l'immunité cutanée mais également dans l'adhésion cellulaire, le métabolisme des glucides et des lipides. Enfin, nous avons observé la capacité de la méthode de rupture de la barrière cutanée « Cyanoacrylate Skin Surface Stripping » (CSSS), utilisée par la voie transcutanée, à induire la surexpression de cytokines et chimiokines cruciales pour la mise en place d'une réponse immunitaire cutanée. Ces données sont importantes pour l'amélioration de la compréhension des mécanismes immunitaires induits dans la peau et pour la mise en place de nouvelles stratégies vaccinales. / Skin richness in immune cells in antigen presenting cells make the skin a promising site for vaccination strategies. Differences in humoral and cellular responses induced in vivo were observed in humans, between studies using intradermal and transcutaneous vaccine administration compared to conventional routes. Theses results highlight that immune molecular mechanism induced in the skin remains poorly understood. An ex vivo human skin explant model was used to analyze early immune events induced after cutaneous antigen administration. We have demonstrated, for the first time, the role of IL-32 produced by keratinocytes in Langerhans cell activation, after TLRs agonists skin cells stimulation. A proteomic analysis of modifications induced in skin microenvironment, after intradermal Influenza vaccine administration, showed the detection of new protein biomarkers from cells adhesion signalling and carbohydrates and lipids metabolism associated with known protein biomarkers from cutaneous inflammatory. In addition, we have observed the ability of the Cyanoacrylate Skin Surface Stripping (CSSS) method, a mild skin disruption method, to promote cytokines and chemokines overexpression by epidermal cells, which are crucial in cutaneous immune response establishment. Theses results allow the better comprehension in immune molecular and cellular mechanism induced in the skin and the development of new vaccination strategies.

Le développement de nouvelles stratégies vaccinales et le traitement de nombreuses pathologies dermatologiques font partis des enjeux majeurs des années à venir. L'étude et la compréhension des mécanismes de réponses immunitaires cutanées sont ainsi essentielles. Les cellules de Langerhans épidermiques et les cellules dendritiques dermiques jouent un rôle central dans l'immunité adaptative spécifique à un pathogène, et dans l'immunité innée, de par leur fonction de présentation des antigènes (APC), mais également d'activateur et de régulateur de l'action des autres cellules immunitaires. Durant ce travail de recherche, nous avons mis au point et testé plusieurs modèles d'étude des mécanismes de l'immunité cutanée. Un premier modèle de " souris humanisées " a été mis au point, à partir de souris immunodéprimées NSG HLA-A2 tg et de greffes de peau humaine. Une fois le modèle techniquement mis au point, nous avons vérifié de la conservation et de la fonctionnalité des APC. La faible conservation des APC au-delà de plusieurs semaines, nous a conduit à mettre au point un deuxième modèle de " souris humanisées " qui bénéficiaient d'injections intra-hépatiques de progéniteurs hématopoïétiques humains. La colonisation en APCs cutanées humaines n'étant pas suffisante, il a fallu injecter aux souris des APCs provenant du même sang que les progéniteurs hématopoïétiques afin d'obtenir une réponse immunitaire suffisante. La faible concentration en APC cutanées de ce modèle, la lourdeur et le coût de mise au point sont des limites non négligeables pour l'utilisation de ce support d'étude. Ces souris humanisées sont d’excellents modèles d’étude, mais ils présentent chacun leurs limites. Lorsque cela est possible il est ainsi plus simple d’utiliser des explants cutanés frais. Nous avons quantifié les APC cutanées en fonction du site d’origine (abdomen, seins…) et de l’âge du donneur de ces explants issus de chirurgie plastique. Sur les 21 explants testés, nous n’avons pas retrouvé de différence significative dans la concentration en APC quel que soit le site et l’âge du donneur. Ces 3 modèles offrent des possibilités d’étude des mécanismes de l’immunité cutanée, nous les utilisons actuellement au sein du laboratoire pour des tests vaccinaux, et pour l’étude du rôle de l’IL-32 produite par les kératinocytes impliqués dans l’activation des cellules de Langerhans. / The development of new vaccination strategies and the treatment of many dermatological pathologies are among the major challenges of the years to come. The study and understanding of the mechanisms of cutaneous immune responses are thus essential. Epidermal Langerhans cells and dermal dendritic cells play a central role in pathogen-specific adaptive immunity, and in innate immunity, by their antigen presenting function (APC), but also as an activator and regulator of the action of other immune cells.During this research, we developed and tested several models for the study of the mechanisms of cutaneous immunity. A first model of "humanized mice" was developed from immunosuppressed NSG HLA-A2 tg mice and human skin grafts. Once the model was technically developed, we verified the conservation and functionality of the APCs. The low PCA retention beyond several weeks, led us to develop a second model of "humanized mice" that benefited from intrahepatic injections of human hematopoietic progenitors. Since colonization in human skin APCs was not sufficient, it was necessary to inject the APCs from the same blood as the hematopoietic progenitors to obtain a sufficient immune response. The low concentration of skin APCs in this model, the cumbersomeness and the cost of development are not insignificant limits for the use of this study support.These humanized mice are excellent models of study, but they each have their limitations. Where possible, it is thus easier to use fresh skin explants. We quantified the cutaneous APCs according to the site of origin (abdomen, breasts ...) and the age of the donor of these explants resulting from plastic surgery. Of the 21 explants tested, there was no significant difference in APC concentration at any site and age of the donor.These three models offer possibilities for studying the mechanisms of skin immunity, we are currently using them in the laboratory for vaccine tests, and for studying the role of IL-32 produced by the keratinocytes involved in l activation of Langerhans cells.