Orientador: Reinaldo Marchetto / Coorientador: Saulo Santesso Garrido / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Pietro Ciancaglini / Resumo: Este trabalho descreve a síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS) derivados de toxinas bacterianas, tais como CcdB e ParE, e a produção de sistemas nanoestruturados como lipossomas e microemulsões. As toxinas intracelulares, produzidas por sistemas de morte pós-segregacional (PSK) em bactérias são exemplos recentes de agentes inibidores de enzimas fundamentais para a reprodução do microrganismo. Resultados promissores foram obtidos em relação a inibição da atividade da DNA girase, por derivados peptídicos destas duas proteínas. In vitro, os valores de concentração inibitória têm sido abaixo de 5 μmol.L-1, porém ensaios in vivo não demonstraram reprodutibilidade, basicamente devido à baixa permeabilidade da membrana bacteriana a estes derivados. Desta forma, foram produzidos lipossomas e microemulsões com o objetivo de promover o acesso de moléculas peptídicas sintéticas, derivadas do CcdB e ParE, ao meio intracelular e, conseqüentemente, aos seus alvos: DNA girase ou topoisomerase IV. Lipossomas do tipo SUV (small unilamellar vesicles) foram preparados por extrusão a partir de fosfatidilcolina de soja e estearilamina e mostraram uma eficiência de encapsulação de 77% e inibiram o crescimento tanto de bactéria Gram positiva quanto Gram negativa em 58 e 75%, respectivamente. Sistemas microemulsionados a base de fosfatidilcolina de soja, Tween 20, etanol e ácido oléico apresentaram uma incorporação do peptídeo acima de 90% e a formulação com 15% de ácido oléico e CcdBET2 a 4 μmol.L-1 apresentou uma inibição do crescimento de bactéria Gram negativa de 75,5%. O diâmetro dos lipossomas foi medido por espalhamento dinâmico de luz e as microemulsões foram caracterizadas por microscopia de luz polarizada e sua viscosidade determinada por reologia. Portanto, lipossomas e microemulsões podem ser utilizados como sistemas de drug delivery para análogos peptídicos derivados do CcdB e do ParE / Abstract: This work describes the synthesis of peptides derived from bacterial toxins, such as CcdB and ParE, by solid phase peptide synthesis (SPPS) and the production of nanostructured systems such as liposomes and microemulsions. Intracellular toxins produced by systems of killer post-segregational (PSK) in bacteria are recent examples of inhibitors of key enzymes for the reproduction of the microorganism. Promising results were obtained for the inhibition of DNA gyrase activity by peptide derivatives of these proteins. In vitro, the IC100 values have been below 5 μmol.L-1, but not demonstrated in vivo reproducibility, mainly due to the low permeability of the bacterial cell to these derivatives. Thus, the aim with this work was develop of liposomes and microemulsions to promote access of synthetic peptide molecules derived from the CcdB and ParE, to the intracellular medium and consequently to their targets: DNA gyrase and topoisomerase IV. Liposomes SUV type (small unilamellar vesicles) were prepared by extrusion from soybean phosphatidylcholine and estearilamina and showed an encapsulation efficiency of 77% and inhibited the growth of both Gram positive and Gram negative in 58 and 75% respectively. Microemulsion systems based soybean phosphatidylcholine, Tween 20, ethanol and oleic acid showed an incorporation of the peptide above 90% and the specific formulation with 15% oleic acid and the 4 μmol.L-1 CcdBET2 incorporate showed a growth inhibition of Gram negative of 75.5%. The diameter of liposomes was measured by dynamic light scattering and microemulsions were characterized by polarized light microscopy and its viscosity determined by rheology. Therefore, liposomes and microemulsions may be used as drug delivery systems for peptide analogues derived from the CcdB and ParE / Mestre

Orientador: João Ruggiero Neto / Banca: João Procópio de Araújo Filho / Banca: Maria Teresa Lamy / Banca: Roberto da Silva / Banca: Valmir Fadel / Resumo: Neste trabalho estudamos a conformação em ambientes anisotrópicos e a atividade lítica em vesículas aniônicas e zwitteriônicas de um conjunto de peptídeos biologicamente ativos, extraídos de veneno de vespas solitárias, que se caracterizam por usar seus venenos para paralisar as presas com as quais alimentam suas larvas. Esses peptídeos que são desgranuladores de mastócitos, apresentam atividade antimicrobiana e a maioria deles não é hemolítica. Possuem entre 10 e 15 resíduos, são catiônicos, com alta proporção de resíduos carregados e polares, e são lineares e helicoidais em meios miméticos de membranas. Buscamos correlacionar a atividade lítica em vesículas de diferentes composições, analisada em experimentos de fluorimetria, às mudanças conformacionais, induzidas por diferentes ambientes miméticos, monitoradas por dicroísmo circular, complementando com a análise das características físico-químicas como comprimento da cadeia, amidação do terminal-C, carga líquida, influências no macrodipolo da hélice, hidrofobicidade, momento hidrofóbico e ângulo polar. Observamos que estes peptídeos apresentam intensa atividade em membranas modelo, interagem preferencialmente com bicamadas aniônicas, e sua atividade lítica acontece de modo cooperativo tanto em vesículas aniônicas como nas zwitteriônicas. Com exceção de Anoplin, todos os peptídeos com ação antimicrobiana apresentam curvas de dose-resposta que mostram uma dependência sigmoidal com a concentração do peptídeo. Isso sugere que esses peptídeos se acumulam na superfície da vesícula até atingir uma concentração crítica, além da qual o vazamento aumenta cooperativamente. De uma forma geral os peptídeos mais eficientes como antimicrobianos, são também aqueles caracterizados pela maior eficiência em permeabilizar vesículas aniônicas do tipo PCPG 7030 e por baixas razões limite P/L. / Abstract: Solitary wasps use their venoms to paralise prays to feed their larvae. A set of biologically active peptides, obtained from these venoms, have been investigated in relation to the conformational changes they undergo in anisotropic environments and their lytic activity on zwitterionic and anionic vesicles. These peptides are mast cell degranulators, present antimicrobial activities and most of them are not hemolytic. They are cationic, their chain length are 10 to 15 residues long, with high hydrophilic / hydrophobic ratio; they are linear and helical in membrane mimetic environments. We searched correlation between the lytic activity in vesicles of different compositions, monitored in fluorimetric experiments, and conformational changes, induced by varied mimetic media, monitored by circular dichroism. The results have been also correlated with peptides' physical-chemical parameters such as chain length, amidated or carboxylated C-terminal, net charge, influences on the helix macrodipole, hydrophobicity, hydrophobic moment and polar angle. We observed that these peptides present intense activity on model membranes, they interact preferentially with anionic bilayers, and their lytic activity is a cooperative process either in anionic or in zwitterionic vesicles. Exception made to Anoplin, all the other peptides that have antimicrobial activity present in their dose-response curves a sigmoidal dependence with the peptide concentration. This fact suggests that these peptides accumulate on the vesicles surface until they reach a threshold concentration, beyond which leakage increases cooperatively. As a general rule, the most efficient antimicrobial peptides are also those characterized by efficient permeabilization of anionic vesicles, namely PCPG 7030 and by small threshold P/L ratios. / Doutor

Orientador: Mario Sergio Palma / Banca: Luiz Alberto Beraldo de Moraes / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Banca: Everardo Magalhães Carneiro / Banca: Yara Cury / Resumo: Os peptídeos possuem um papel essencial para as funções fisiológicas de animais, plantas e de alguns microrganismos, e frequêntemente apresentam-se como candidatos a novas drogas na sua forma natural, servindo como modelos para o "desenho" de peptídeos modificados, para uma obtenção de perfis farmacológicos melhores. Neste contexto, os venenos das vespas sociais são interessantes sob o ponto de vista da pesquisa, uma vez que são ricos em peptídeos policatiônicos envolvidos com processos inflamatórios (lise de membranas, Desgranulação de mastócitos, quimiotaxia, entre outros processos), além de efeitos antibióticos contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Com base nisso, o objetivo deste trabalho foi realizar uma bioprospecção dos diferentes componentes peptídicos presentes nos venenos das vespas sociais Agelaia pallipes pallipes e Agelaia vicina, através da identificação e da caracterização estrutural e funcional dos componentes peptídicos mais abundantes destes venenos. Para isso, os venenos das vespas supracitadas foram extraidos em acetonitrila, fracionados por cromatografia de fase reversa e analisado por espectrometria de massas (ESI-MS e ESI-MSn). Todos os peptídeos caracterizados foram sintetizados manualmente por estratégia Fmoc, para a realização de ensaios farmacológicos e fisiológicos. Além de abrir novas vertentes de estudos estruturais e funcionais, o presente projeto alcançou os objetivos inicialmente almejados, identificando e caracterizando estruturalmente doze peptídeos presentes nos venenos das duas espécies de vespas. As denominações e atividades biológicas dessas moléculas foram: Protonectina apresentou-se lítico para hemáceas, degranulador de leucócitos quimiotático, induziu o fenômeno de hiperalgesia e foi edematogênico; o peptídeo Protonectina (1-4)-OH apresentou-se hemolítico para eritrócitos e desgranulador... (resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Peptides have an important role on physiologic functions of animals, plants and microorganisms. These natural peptides frequently are candidates for new drugs natural, and are used as models for the construction of modificated peptides in order to improve their pharmacological activities. From academic point of view, social wasp venoms are interesting once they are rich in policationic and polifunctional peptides that are involved with inflammatory processes (membrane lyses, mast cell degranulation, chemotaxis, and other processes), antimicrobial effects against Gram-positive and Gram-negative bacterias. Therefore, the main objective of this study was to bioprospect a diversity of peptidic compounds from the venoms of the neotropical social wasps Agelaia pallipes pallipes and Agelaia vicina through peptidomic analysis, identifying and characterizing these molecules structurally and functionally. For that, the venom from both wasps was extracted in MeCN 50% (v/v), analyzed and sequenced by ESI-MS, ESI-MSn. All characterized peptides were manually synthesized by Fmoc strategy and used for pharmacological and phisiological activities. This work has reached the initially poposed objectives by the indentification and functional characterization of twelve peptides from the social wasps venoms studied. Of these identified molecules, nine were isolated from the social wasp A. p. pallipes venom (Protonectin (1-4)-OH, Protonectin (1-5)-OH, Protonectin (1-6)-OH, Protonectin (7-12); Agelaia MP-I, Agelaia MP-II, Pallipin-I, Pallipin-II, and Pallipin-III), and from the venom of the social wasp A. vicina, four peptides were characterized (Protonectin (7-9)-OH, Protonectin, Protonectin (1-6), and Agelaia MP-I). These results show that the venom of both wasps are very similar to each other, probably due to the kinship of such species. Functionally, the peptide protonectin is lytic to erythrocytes... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Antonio de Miranda / Banca: Hosana Maria Debonsi Navickiene / Resumo: A Stichodactyla helianthus é uma anêmona relativamente abundante nos mares de Cuba apresentando grande potencialidade como fonte de peptídeos biologicamente ativos. Dentre estes peptídeos, estão duas citolisinas: as esticolisinas I (St I) e II (St II). Essas duas toxinas possuem como principal característica a capacidade de formação de poros em eritrócitos, ou seja, alta atividade hemolítica (AH), no entanto a St II é mais hemolítica que a St I. Tendo em vista que as principais alterações que diferenciam estas citolisinas (St I e St II) estão na região amino-terminal (primeiros 30 resíduos), este trabalho teve como um dos objetivos sintetizar e comparar fragmentos amino-terminais destes polipeptídeos, visando entender a diferença de atividade hemolítica. Os resultados obtidos mostraram que os peptídeos St I 12-31 e St II 11-30 possuem a mesma atividade hemolítica. Esse dado mostra que a alteração de Glu por Gly e de Gln por Glu não afeta a atividade hemolítica dos mesmos. Já os peptídeos St I 1-31 e St II 1-30, respectivamente, mostraram diferenças em suas atividades hemolíticas, estas diferenças de atividade podem estar relacionadas à região dos resíduos de 1 a 10 da seqüência peptídica. Outro resultado interessante foi que o peptídeo St I 2-31 (sem o resíduo de serina N-terminal) apresentou AH intermediária entre os St I 1-31 e St II 1-30, mostrando que a adição da serina à St I é responsável por parte da perda da atividade desta citolisina. Outro objetivo deste trabalho foi avaliar a importância da polaridade da extremidade amino-terminal da esticolisina II. Para isto, fragmentos peptídicos contendo a região amino-terminal da St II, marcado com Trp na posição 2, foi sintetizado alterando-se a carga desta extremidade (acetilado, acrescido de Ser, Asp ou Lys) / Abstract: Stichodactyla helianthus is a relatively abundant sea anemone found in the seas of Cuba, presenting a largely potent source of biologically active peptides. Among these peptides, are two citolysins: the sticholysins I (St I) and II (St II). These two toxins possess as main characteristic the capacity of forming pores in erythrocytes, in other words, high hemolytic activity (HA), however, the St II is more hemolytic than the St I. As far as we know that the main alterations that differentiate the proteins St I and St II are in the region amino-terminal (first 30 residues), this study has as one of the objectives the synthesizing and comparing of amino-terminal fragments of those polypeptides aiming to understand the difference of hemolytic activities. The results obtained had shown that the peptides St I 12-31 and St II 11-30 possess the same hemolytic activity. This data sample shows that the alteration of Glu for Gly and Gln for Glu does not affect the hemolytic degree of the same ones. Even then the peptides St I 1-31 and St II 1-30, respectively, had sample differences in its hemolytic activity, indicating that the different activities can be related within the region of 1 the 10 of the sequence. Another interesting result was that the peptides St I 2-31 (without the serine residue N-terminal) presented intermediary AH between St I 1-31 and St II 1-30, showing that the addition of the serine to St I is responsible for part of the losing activity in this citolysin. Another objective of this study is to evaluate the importance of polarity of the extremity amino-terminal of sticholysin II. To do this, the peptides containing the region amino-terminal of St II, marked with Trp in position 2, was synthesized changing the load of this extremity (acetylated, increased of Ser, Asp or Lys) / Mestre

Resumo: Materiais mesoporosos têm sido largamente estudados devido ás suas características e potenciais aplicações. A sílica mesoporosa apresenta elevada área de superfície específica (~1000 m2.g-1) e tamanho de poros usualmente em torno de 2-30 nm, atraindo atenção para aplicações em catálise, adsorção e troca iônica. O peptídeo de crescimento osteogênico (OGP) é um tetradecapeptídeo endógeno, cuja forma ativa gera ligações covalentes com as proteinases, mostrando ser um bom agente anabólico e estimulador hematopoiético. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi à preparação de materiais inorgânicos mesoporosos, a partir de sílica e de um surfactante não-iônico como agente direcionador de estrutura, incorporados com OGP, para atuarem como biomateriais na regeneração óssea. O peptídeo foi sintetizado pelo método em fase sólida (SPFS; estratégia Fmoc); foi purificado e caracterizado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), Espectrometria de Massas e Análise de Aminoácidos. Os materiais sólidos foram caracterizados por Espectroscopia na região do Infravermelho (FT-IR), Difração de Raios X (XRD), Espalhamento de Raios X à Baixo Ângulo (SAXS), Adsorção-dessorção de Nitrogênio a 77K (BET), Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) e Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM). A bioatividade in vitro desses materiais em Simulated Body Fluid (SBF) foi verificada por FTIR, SEM e XRD, e a adsorção e liberação do peptídeo marcado com 5,6-carboxifluoresceína da matriz mesoporosa foi monitorada por Espectroscopia de Fluorescência. Ficou evidente que a composição do material refletiu em diferentes características físicas, onde a área de superfície específica foi de 880, 484, 220 m2.g-1, para a LMSiO, LMSiCaP I e II, respectivamente, que por sua vez influenciou na porcentagem de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesoporous materials have been widely studied due to their characteristics and potencial applications. The mesoporous silica has a high specific surface area (1000 m2.g-1) and pore size is usually around 2-30nm, and it has attracted much attention for applications in catalysis, adsorption and ion exchange. The Osteogenic Growth Peptide (OGP) is an endogenous tetradecapeptídeo, which generates the active form covalent bonds with proteases, showing to be a good anabolic agent and hematopoietic stimulator. In this sense, this work presents the preparation of inorganic mesoporous materials from silica and a nonionic surfactant as a structure director agent incorporated with OGP to act as biomaterials in bone regeneration. The peptide was synthesized by solid-phase method (SPFS; Fmoc strategy), purified and characterized by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Mass Spectrometry and Aminoacid Analysis. The solids were characterized by Infrared Spectroscopy (FT-IR), X-ray Diffraction (XRD), Small Angle X-ray Scattering (SAXS), Adsorption-desorption of Nitrogen at 77K (BET), Transmission Electron Microscopy (TEM) and Scanning Electron Microscopy (SEM). The in vitro bioactivity of these materials in Simulated Body Fluid (SBF) was studied by Infrared Spectroscopy (FT-IR), Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-ray Diffraction (XRD), and loading and release of the peptide labeled with 5,6-carboxyfluorescein of mesoporous matrix was monitored by Fluorescence Spectroscopy. It was evident that the composition of the material reflects different physical characteristics, where the specific are was 880, 484, 220 m2.g-1 for LMSiO, LMSiCaP I e II, respectively, which in turn influenced the percentage of incorporation of the peptide (99% in LMSiO, 55% in LMSiCaO I e no adsorption in LMSiCaP II). The results... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Reinaldo Marchetto / Coorientador: Marco Antônio Utrera Martines / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Andrea Simone Stucchi de Camargo Alvarez Bernardez / Mestre

Orientador: José Roberto Ruggiero / Banca: Mário Sérgio Palma / Banca: André Farias de Moura / Resumo: Mastoparanos são peptídeos helicoidais, anfipáticos e catiônicos que apresentam diversas funções biológicas, entre elas temos a ação antimicrobiana, que está relacionada à sua afinidade por membranas aniônicas de bactérias e sua capacidade lítica. Recentes estudos têm mostrado que a formação de poros em membranas é facilitada pela agregação de peptídeos carregados. Esta situação favoreceria a hipótese de que a formação de poro é essencialmente similar a eletroporação molecular. Neste trabalho investigamos a estabilidade de um dímero do Eumenine Mastoparan-AF, um membro catiônico (+4) da família dos mastoparanos, em água e mistura TFE-água, mimetizando meio aquoso e meio membranar, respectivamente. Particular atenção foi colocada nas interações eletrostáticas de grupos carregados e polares, principalmente naqueles que participam de ligações de hidrogênio entre os dois peptídeos e na hidratação da cadeia principal e cadeias laterais apolares. Uma estrutura dimérica representativa foi inicialmente obtida por um método de docking rígido e submetida às simulações de dinâmica molecular usando o pacote GROMACS. Resultados de 50 ns de simulação em água mostram uma perda parcial do conteúdo helicoidal dos peptídeos e a estrutura dimérica se desestrutura devido às interações desfavoráveis dos resíduos hidrofóbicos com a água. Por outro lado, simulações em mistura TFE-água mostram que o dímero é estável durante o tempo observado, porque as moléculas de TFE se agrupam ao redor de resíduos hidrofóbicos criando um meio apropriado que protege as ligações de hidrogênio intra- e inter-peptídeos. Surpreendentemente, parece que a repulsão eletrostática não é a principal razão para a desagregação do dímero, o que reforça a importância da. / Abstract: Mastoparans are helical, amphipathic and cationic peptides that display many biological functions, among which is the antimicrobial activity, which is related to its affinity for anionic membranes of bacteria and its lytic capacity. Recent studies have shown that pore formation on membranes is facilitated by the aggregation of charged peptides. This situation would favor the hypothesis that pore formation is essentially similar to the molecular electroporation. In this work, we investigate the stability of a dimer of the Eumenine Mastoparan-AF, a cationic (+4) member of the Mastoparan family, in water and TFE-water mixture, mimicking aqueous and membrane environments, respectively. Particular attention have been put on the electrostatic interactions of charged and polar groups, mainly those participating of hydrogen bonds between the two peptides and on the hydration of the backbone and apolar side chains. A representative dimer conformation was initially obtained by a rigid docking procedure and submitted to molecular dynamics simulations using the GROMACS package. Results of 50 ns of simulation in water show a partial loose of the helical content of the peptides and the dimer structure breaks down due to unfavorable interactions of hydrophobic residues with water. On the other hand, simulations in TFE-water mixture show the dimer is stable in the running time, because TFE molecules assemble around hydrophobic residues creating a suitable environment that protect the intra- and inter-peptides hydrogen bonds. Surprisingly, it seems that electrostatic repulsion is not the main reason for disaggregation of the dimer what reinforces both the importance of aggregation and the molecular electroporation mechanism for pore formation. / Mestre

Resumo: A existência de cepas resistentes aos antibióticos tradicionais aumenta a necessidade do desenvolvimento e estudo de novas drogas. Um grupo destas moléculas é o dos peptídeos antimicrobianos (PAMs). A ação dos PAMs é atribuída à formação de poros na membrana, aumentando sua permeabilidade e levando a morte celular. Somado aos estudos visando à elucidação dos mecanismos de ação dos PAMs, outros vêem sendo conduzidos para avaliar a importância de cada região da sequência em sua atividade biológica. Esta tese apresentou os estudos estruturais e biológicos de um peptídeo bioativo, proveniente da secreção cutânea da rã Hypsiboas albopuctatus, nomeado hilina a1 (Hy-a1) (IFGAILPLALGALKNLIK-NH2). O peptídeo hy-a1 é um peptídeo bioativo proveniente da secreção cutânea da rã Hypsiboas albopuctatus. Esta molécula mostrou atividade contra diversos tipos celulares, incluindo bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, fungos, além de capacidade hemolítica. Este trabalho avaliamos a importância da carga e da estrutura da região N-terminal deste peptídeo. Para isto o peptídeo hy-a1, 4 análogos contendo o Trp substituindo a Leu na posição 6 e com modificações em sua extremidade N-terminal ([Trp6 ]hy-a1, Acetil-[Trp6 ]hy-a1, Lys-[Trp6 ]hy- a1 e Asp-[Trp6 ]hy-a1), e outros 2 análogos contendo alterações pontuais no meio da cadeia, foram manualmente sintetizados por meio da técnica de síntese de peptídeo em fase sólida. Os resultados obtidos demonstram que a síntese, por meio do protocolo Fmoc/tBu, utilizado na síntese dos peptídeos deste trabalho, foi viável. O processo de purificação dos materiais brutos obtidos por meio de HPLC também se mostrou eficiente e viabilizou a obtenção do material com índice de pureza superior a 95%. As atividades biológicas dos peptídeos obtidos foram determinadas por meio da análise da capacidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The presence of microorganisms that are resistant to conventional antibiotics, has led to the search of new drugs. One group of these molecules is the antimicrobial peptides (AMPs). The AMPs make the bacterial membrane permeable, which increases its permeability leading to cell death. Several studies towards the mechanism of action are being performed, as well as studies to analyze the importance of each region of the peptide sequence in its function. In this work, we present the structural and biological studies of a bioactive peptide, which was first isolated from the skin secretion of the frog Hypsiboas albopuctatus, named hylin a1 (Hy-a1) (IFGAILPLALGALKNLIK-NH2). The bioactive peptide hy-a1 has shown activity against several kind of microorganism, including Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungus, moreover presents hemolytic activity. In the present work we evaluated the importance of the charge and the structure of the N-terminal region of this peptide. In this manner, the original peptide hy-a1, 4 analogues containing a Trp substituted for Leu at position 6 with modifications at the N-terminal ([Trp6 ]hy-a1, Acetil-[Trp6 ]hy-a1, Lys-[Trp6 ]hy-a1 and Asp- [Trp6 ]hy-a1), and 2 others analogues containing modifications in the middle of the chain, were manually synthesized by solid phase peptide synthesis. The results demonstrated that the Fmoc/tBu synthesis protocol was viable. The purification process of the crude peptides by HPLC also was efficient and allowed to obtain peptide. The biological activity of the peptides was assayed by the antibacterial, antifungical and hemolytic activities. The results demonstrated that: 1) the greater number of the peptides presented activity at a concentration of mmol/L, but with different minimal inhibitory concentration (MICs) for differ microorganism; 2) modifications on the N-terminus charge affect the activity... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Eduardo Maffud Cilli / Coorientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Anselmo Gomes de Oliveira / Banca: Taís Maria Bauab / Banca: Pietro Ciancaglini / Banca: Maria Terêsa Machini de Miranda / Doutor

Orientador: José Roberto Ruggiero / Banca: Pedro Geraldo Pascutti / Banca: José Maria Pires / Banca: Alexandre Suman de Araújo / Banca: Sabrina Thais Broggio Costa / Resumo: Peptídeos antimicrobianos são moléculas biologicamente ativas que, geralmente, tem as membranas fosfolipídicas como alvo primário. Resultados de diferentes técnicas experimentais têm sugerido que esses peptídeos permeabilizam as membranas pela formação de poros. Parte dos peptídeos caracterizados apresentam especificidade de disrupção para membranas de bactérias, em detrimento das membranas dos hospedeiros. Essa característica tem atraído a atenção da comunidade científica internacional, porque indica que estas moléculas podem ser modelos para o desenvolvimento de novos antibióticos, portanto o entendimento do mecanismo de ação, ou seja, do mecanismo de formação de poro, tem extrema importância. Simulações por Dinâmica Molecular foram produzidas para investigarmos o impacto que peptídeos antimicrobianos da família Mastoparano tem sobre membranas lipídicas modelo. Dois cenários foram explorados: (i) de baixa concentração peptídeo/lipídeo, P/L=1/128, que consistia de simulações fine-grained das interações de um peptídeo com uma bicamada pura de 128 lipídeos aniônicos (POPG) ou zwiteriônicos (POPC); (ii) de alta concentração, P/L=1/21, que abordava as interações de seis peptídeos com uma bicamada mista de 128 lipídeos POPC/POPG (1/1) usando uma modelagem coarse-grained. Tomando o peptídeo MP1 como caso paradigmático, verificamos que em baixo P/L é possível sugerir que sua característica seletiva surge da capacidade de coordenar e perturbar maior número de lipídeos em membrana aniônica comparada à neutra. Essa capacidade fica acentuada nas simulações com membrana mista, onde a atração dos lipídeos aniônicos pelos peptídeos catiônicos guiou a separação local e a formação de domínios de lipídeos aniônicos, o que facilitou o afinamento local da membrana e a formação de poro transmembrânico. Esses achados ajudam a explicar como peptídeos / Abstract: Antimicrobial peptides are biologically active molecules that, usually, have the phospholipid membranes as a primary target. Results from different experimental techniques have suggested these peptides permeabilize membranes by the pore formation. Part of the characterized peptides have specificity of disruption for bacterial membranes, instead of host membrane. This feature has attracted the attention of the international scientific community, because it indicates that these molecules can be models for the development of novel antibiotics, so understanding the mechanism of action, ie, the mechanism of pore formation, is extremely important. Molecular dynamics simulations were performed to investigate the impact of antimicrobial peptides from the Mastoparano family have on model lipid membranes. Two scenarios were explored: (i) of low peptide/lipid concentration, P/L=1/128, which consisted of fine-grained simulations of the interactions of a peptide with a pure bilayer of 128 anionic (POPG) or zwitterionic (POPC) lipids; (ii) of high concentration, P/L=1/21, which addressed the interactions of six peptides with a mixed bilayer of 128 POPC/POPG (1/1) lipids, using a coarse-grained modeling. Taking the MP1 peptide as a paradigmatic case, we found that in low P/L is possible to suggest that its selective feature arises of its ability to coordinate and disturb large number of lipids in the anionic membrane compared to neutral one. This ability is accentuated in simulations with mixed membrane, where the attraction of the anionic lipids by the cationic peptides led to the local segregation and formation of POPG lipid domains, which facilitated the local thinning of the membrane and the formation of transmembrane pore. These findings help to explain how short peptides, such as MP1, are able of forming pores in a membrane whose thickness is larger than the length of the peptide / Doutor

Resumo: Angiotensina II, um peptídeo hipertensivo, e bradicinina, um peptídeo hipotensivo, são fatores humorais cruciais para a regulação da pressão sanguínea. A enzima chave desse sistema é a enzima conversora de angiotensina que produz angiotensina II a partir de angiotensina I e degrada bradicinina. A descoberta dos primeiros inibidores naturais dessa enzima, os peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs), tornou possível o desenvolvimento dos primeiros medicamentos utilizados no controle da pressão arterial humana. Caracteristicamente, os BPPs contêm de 5 a 13 resíduos de aminoácidos apresentando um resíduo de piroglutâmico no N-terminal e um resíduo de prolina no Cterminal. O precursor de BPPs encontrado na glândula de veneno de Bothrops jararaca contém 256 resíduos de aminoácidos e codifica para sete BPPs alinhados em tandem seguidos pelo peptídeo natriurético tipo-C. Até o momento, não se conhecem os mecanismos envolvidos para a liberação desses peptídeos da proteína precursora. Dessa forma, a resolução da estrutura dessa proteína pode contribuir para a elucidação do mecanismo evolvido no processamento do precursor para a liberação dos BPPs. Duas construções da proteína precursora de BPPs (domínio BPP e domínios BPP+CNP) da glândula de veneno de B. jararaca foram expressas, purificadas e suas identidades confirmadas por experimentos de western blotting. A pureza das amostras foi avaliada por SDS-PAGE e a presença de enovelamento após expressão heteróloga foi observada por experimentos de dicroísmo circular e fluorescência. Os ensaios de cristalização não foram promissores. Isso pode ser explicado pela baixa concentração da proteína usada no experimento. Assim, devido ao baixo nível de expressão de ambas as proteínas, métodos para maximização da expressão foram empregados resultando em significante...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Angiotensin II, a hypertensive peptide, and bradykinin, a hipotensive peptide, are crucial humoral factors for the regulation of blood pressure. The key enzyme for this system is the angiotensin-converting enzyme that produces angiotensin II from angiotensin I and degrades bradykinin. The discovery of the first natural inhibitors for this enzyme, the bradykinin potentiating peptides (BPPs), made it possible to develop the early drugs aimed at controlling unbalanced cardiovascular functions. Characteristically, BPPs contain 5 to 13 amino acid residues that have a pyroglutamyl residue at the N-terminus and a praline residue at the C-terminus. The BPP precursor protein contains 256 amino acid residues coding for seven BPPs aligned in tandem followed by the C-type natriuretic peptide. At present, there are no suggested mechanisms for understanding the release of BPPs from the precursor protein. Two constructs of the BPP precursor protein (BPP domain and BPP+CNP domains) from the venom gland of Bothrops jararaca were over-expressed, purified and the identity of both recombinant proteins confirmed by western blotting experiments. The purity of the samples was assessed by SDS-PAGE and the protein fold after expression was observed by circular dichroism and fluorescence experiments. Crystallization assays were not successful, probably due to the low protein concentration used for the experiment. Considering the low expression level observed for both recombinant proteins, the experimental methods were optimized to maximize the yield and resulted in high protein amounts in inclusion bodies. Methods were applied aiming at the solubilization of the proteins from the insoluble fraction and protein purification under denaturing conditions was carried out yielding high amounts of pure protein. Until this moment, none of the procedures were successful in producing refolded proteins. Work ...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Coorientador: Mirian Akemi Furue Hayashi / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Patrick Jack Spencer / Mestre