Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-09-14T12:25:10Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial_Leilane Sousa (Pré-Textuais, Rev. Lit e Objetivos).pdf: 1252437 bytes, checksum: d055c176d626e63f0a9ad128366526d6 (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-09-14T12:25:25Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial_Leilane Sousa (Pré-Textuais, Rev. Lit e Objetivos).pdf: 1252437 bytes, checksum: d055c176d626e63f0a9ad128366526d6 (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-14T12:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DissertaçãoParcial_Leilane Sousa (Pré-Textuais, Rev. Lit e Objetivos).pdf: 1252437 bytes, checksum: d055c176d626e63f0a9ad128366526d6 (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Alternative methods are being developed to reduce, refine, and replace (3Rs) animals used in experiments and have been applied to test the safety of cosmetics and medicines. It is important to consider the difficulties that Brazil faces with customs and perishability issues that hinder and even prevent the use of commercially available reconstructed human skin models. The aim of this work was to develop a reconstructed human skin model (PHR-UFAM) and test its applicability for cytotoxicity and genotoxicity assays. For this, skins were generated using permanent human keratinocytes and fibroblasts (embedded in collagen) cells. The quality control was performed by morphological and immunohistochemical analyses, viability by MTT test with negative control, and barrier function test. The applicability for genotoxicity assays was evaluated by micronucleus test, neutral and alkaline comet, and modified comet for detection of DNA methylation sites with positive controls of each test defined by OECD and literature. The best condition tested allowed the development of a reconstructed human skin (PHR-UFAM) with epidermis presenting expression of immunohistochemical markers: epithelial (cytokeratins) and dermal (vimentin). The model followed quality parameters (histology, viability, and barrier function) and presented morphological similarity with models recognized and validated by OECD. The applicability of skin model for genotoxicity assays demonstrated the effectiveness of the positive controls: Mitomycin C that was able to increase significantly the micronucleus frequency when tested at concentrations of 1,5 e 3 μg/mL (3.03% and 3.51%, respectively); Ethylmethanesulfonate caused damage to the DNA when tested at concentrations of 5 e 10 μM by comet assay in both alkaline (damage index values of 59.3 and 103.7, respectively) and neutral (damage index of 40.7 and 125, respectively) versions; and 5-azacytidine in the modified comet assay for methylation detection, tested at concentrations of 0.5, 1 e 1.5 μM showed reduced damage indexes (107.5, 83.1, and 89.3, respectively). The results were similar to skin models validated by OECD and literature. Thus, with this work it was possible to develop a reconstructed human skin model composed entirely of permanent cells. However, further validation studies are required to prove its effectiveness for cytotoxicity and genotoxicity tests of substances with therapeutic or cosmetic potential. / O desenvolvimento de métodos alternativos in vitro baseia-se no refinamento, redução e substituição ao uso de animais em experimentação e têm sido desenvolvidos para testar a segurança de cosméticos e medicamentos. É importante considerar as dificuldades que o Brasil enfrenta com questões alfandegárias e de perecibilidade que dificultam e até mesmo impedem a utilização de modelos de pele humana reconstruída disponíveis comercialmente. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um modelo de pele humana reconstruída (PHR-UFAM) in vitro utilizando células de cultura permanente e testar suas aplicabilidades para ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade. Para isso, as peles foram geradas utilizando queratinócitos e fibroblastos (embebidos em colágeno) humanos permanentes. O controle de qualidade das peles foi feito por análise morfológica e imunohistoquímica, a viabilidade pelo teste do MTT com o controle negativo e teste de função barreira. A aplicabilidade para ensaios de genotocixidade foi avaliada pelo teste do micronúcleo, cometa em pH alcalino e neutro e cometa modificado para detecção de sítios de metilação no DNA com os controles positivos de cada teste definidos pela OECD e pela literatura. A melhor condição testada permitiu o desenvolvimento de uma pele humana reconstruída (PHR-UFAM) com uma camada epidérmica apresentando expressão de marcadores imunohistoquímicos epiteliais (citoqueratinas) e dérmico (vimentina). O modelo atendeu aos parâmetros de qualidade (histologia, viabilidade e função barreira) e apresentou semelhança morfológica com os modelos reconhecidos e validados pela OECD. A aplicabilidade para ensaios de genotoxicidade evidenciou efetividade dos controles positivos: Mitomicina C, que foi capaz de aumentar significativamente a frequência de micronúcleos em 3,03% e 3,51% nas concentrações de 1,5 e 3 μg/mL; Etilmetanossulfonato, que causou dano ao DNA no modelo de pele quando testado nas concentrações de 5 e 10 μM, avaliado pelo ensaio do cometa tanto na versão alcalina (índices de dano iguais a 59,3 e 103,7, respectivamente) quanto na neutra (índices de dano iguais a 40,7 e 125, respectivamente); e 5-azacitidina no ensaio do cometa modificado para detecção de metilação no DNA testada nas concentrações 0,5, 1 e 1,5 μM, que apresentou índices de dano reduzidos iguais a 107,5, 83,1 e 89,3, respectivamente, no modelo de pele PHR-UFAM. Os resultados foram comparados com o controle não tratado. Diante do exposto, com este trabalho foi possível desenvolver um modelo de pele humana reconstruída composta totalmente de células permanentes semelhante aos modelos validados e reconhecidos na literatura. Contudo, é necessária a realização de estudos de validação complementares que comprovem sua efetividade para ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade de substâncias com potencial terapêutico ou cosmético.