H neurocan και η phosphacan είναι πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης. Η neurocan θεωρείτο οτι είναι μια πρωτεογλυκάνη αποκλειστικά του εγκεφάλου. Η phosphacan έχει μελετηθεί σε προχωρημένα στάδια ανάπτυξης εμβρύων ποντικού και αρουραίου. Δεν ήταν γνωστό πότε αρχίζουν να εκφράζονται και πως κατανέμονται χωρο-χρονικά οι neurocan και phosphacan καθώς το έμβρυο αρχίζει την ανάπτυξή του. Μελετήσαμε την έκφραση της neurocan και της phosphacan με RΤ-PCR και ανοσοφθορισμό στο έμβρυο όρνιθας από το στάδιο Χ (μορίδιο) έως το στάδιο HH17 (29 σωμίτες/πρώιμη οργανογένεση). Επίσης μελετήσαμε το ρόλο της neurocan και phosphacan με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. Το mRNA της neurocan πρωτοανιχνεύτηκε στο στάδιο του προχωρημένου γαστριδίου (HH4) και η έκφραση του ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Τα πειράματα μας του ανοσοφθορισμού επίσης έδειξαν ότι η neurocan άρχισε να ανιχνεύεται στη νευρική πλάκα και στην εξωκυττάρια ουσία στο στάδιο του προχωρημένου γαστριδίου (HH4). Στα έμβρυα στο στάδιο των 19 σωμιτών (ΗΗ13), ο φθορισμός ήταν έντονος στον μυελεγκέφαλο, τη νωτοχορδή, στα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων, στο κάτω τοίχωμα του φάρυγγα, στο ραχιαίο μεσοκάρδιο και μυοκάρδιο και λιγότερο στο ενδοκάρδιο και στα φαρυγγικά τόξα όπου έχουν μεταναστεύσει κύτταρα των νευρικών κρηπίδων. Στο στάδιο των 29 σωμιτών (HH17), η έκφραση της neurocan ήταν ισχυρή στον τελεγκέφαλο, μυελεγκέφαλο και στο νευρικό σωλήνα. Η έκφραση της neurocan ήταν ισχυρή στον αμφιβληστροειδή, λιγότερη στο φακό και έδειχνε μεγάλη ένταση στον κερατοειδή χιτώνα στον οφθαλμό, έντονη στο ραχιαίο μεσοκάρδιο, στο μυοκάρδιο και αχνή στο ενδοκάρδιο στην καρδιά και έντονη στους σωμίτες, στο μεσονέφρο και στις νησίδες αίματος. Σε μια σειρά λειτουργικών πειραμάτων με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της neurocan προκάλεσε τα νευροεξωδερμικά κύτταρα να επιδεικνύουν μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά και ο εγκέφαλος να μην έχει αναπτυχθεί φυσιολογικά. Επίσης ανεστάλη η μορφογένεση της καρδιάς και των σωμιτών στα έμβρυα αυτά. / Neurocan, a chondroitin sulfate proteoglycan, interacts with other molecules of the extracellular matrix and the cell surface and participates in signalling pathways. Phosphacan is a chondroitin/ keratan sulfate proteoglycan that has been studied extensively in the late embryonic and postnatal brain and in the spinal cord. Relatively little is known about the neurocan tissue-specific distribution or function during the development of the embryo. We studied the neurocan and phosphacan spatio-temporal expression pattern by RT-PCR and immunofluorescene in the early chick embryo from the morula stage (stage XI) to early organogenesis (stage HH17, 29 somites). We also studied the role of neurocan and phosphacan by using blocking antibodies directed against neurocan or phosphacan in a set of functional studies. Neurocan mRNA was first detectable at the late gastrula stage (HH4) and its expression was developmentally regulated. Neurocan protein was first detectable in cells of the inchoate neural plate and in the extracellular matrix in embryos at stage HH4. At stage HH13 (19 somites), neurocan fluorescence was intense in the myelencephalon, notochord, neural crest cells, the foregut lower wall, pharyngeal arches, dorsal mesocardium, myocardium and in the endocardium. At stage HH17 (29 somites), neurocan expression was intense in the telencephalon, myelecenphalon, diencephalon and in the neural tube. Expression of neurocan was strong in the retina, lens and intense in the cornea in the eye, intense in the myocardium and lower in endocardium in the heart. In a set of functional studies using monoclonal antibodies directed against neurocan, the inhibition of neurocan function resulted in neural plate duplications, the neurepithelial cells exhibited mesenchymal characteristics and the somite, heart and gut formation were inhibited. The observed neural plate duplications point to an important role of neurocan to modulate the activity and availability of growth factor(s) during the induction of neurectoderm. Phosphacan mRNA was first detectable at the morula stage (XI) and it continued to be expressed during development. At the blastula stage (XIII)phosphacan immunofluorescence was strong in the epiblast and hypoblast. At the gastrula stage (HH3-ΗΗ4), immunofluorescence was strong in the cells around and also ingressing through the streak and in mesenchymal cells. At stage HH8 (4 somites), immunofluorescence was intense in the elevated neural plate, especially in its dorsal surface. This implies a role for phosphacan in the fusion of neural folds medially during the formation of the neural tube. At stage HH11 (13 somites), phosphacan immunofluorescence was strong in the neural tube, somites, gut lower wall and in the myocardium, endocardium and dorsal mesocardium in the heart and intense in the blood islands. By stage HH17 (29 somites), phosphacan immunofluorescence was strong in the myelencephalon and diencephalon, in the lens and retina in the eye, the neural crest cells, the myotome but not the dermatome and sclerotome in somites, the myocardium and endocardium in the heart and the dorsal aorta. Inhibition of function of phosphacan by blocking antibodies showed that phosphacan participates in the fusion of neural folds to form the neural tube, in the opticoele determination to form the retina and in somite, heart and gut morphogenesis.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間健康科学) / 甲第18198号 / 人健博第15号 / 新制||人健||2(附属図書館) / 31056 / 京都大学大学院医学研究科人間健康科学系専攻 / (主査)教授 齋藤 邦明, 教授 三谷 章, 教授 髙橋 良輔 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human Health Sciences / Kyoto University / DFAM