Resumo: Diplodia pinea é um patógeno que causa doença em vários gêneros de coníferas e perdas em plantações comerciais de Pinus devido à seca de ponteiros. D. pinea se reproduz apenas assexuadamente, sendo comum a presença de linhagens clonais (morfotipos A e C) apresentando diferenças no potencial de agressividade com relação ao hospedeiro. Diante da importância econômica do gênero Pinus para o Brasil e no potencial do D. pinea em causar danos nesse gênero, o objetivo deste estudo foi efetuar uma caracterização morfofisiológica, patogênica e molecular de 20 isolados de D. pínea obtidos das regiões Sul e Sudeste do Brasil. O aspecto micelial dos isolados foi avaliado em placas com meio BDA e EMA,a temperatura ótima de crescimento dos isolados, em meio BDA e a esporulação em meio APA, nas temperaturas de 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 °C. Foram avaliados 100 conídios por isolado quanto às dimensões, numero de septos, espessura e aspecto da parede, sob microscópio ótico e eletrônico de varredura. Avaliou-se, também, a parede dos conídios quanto à presença de perfurações. A agressividade dos isolados foi avaliada em mudas de Pinus taeda e Pinus elliottii var. elliottii. A caracterização molecular dos isolados foi realizada através do sequenciamento da região ITS1--5,8S-ITS2 do rDNA. Os isolados apresentaram em meio BDA e EMA micélio algodoado inicialmente branco mudando-se para cinza chumbo. Os conídios avaliados apresentaram dimensões entre 30-39,9 x 12,9-16,5 ?m de largura, principalmente sem septos ou uniseptados. A microscopia eletrônica revelou conídios com parede lisa e sem a presença de pontuações, típica para o morfotipo A. O crescimento dos isolados foi verificado de 12 a 36 °C e a formação de picnídios de 12 a 32 °C, mas os conídios maturos foram observados a 20, 24 e 28 °C. O isolado B11 foi o mais agressivo nas duas espécies de Pinus testadas e a existência de interação foi verificada entre isolados e espécies de Pinus. O sequenciamento formou um clado monofiletico agrupando os isolados de Diplodia pínea. Os resultados indicam que os isolados pertencem ao morfotipo A de D. pinea.