In den vergangenen Jahren rückten Pflanzen-assoziierte Bakterien auf Grund ihrer Bedeutung für die Pflanzengesundheit und das ökologische Gleichgewicht zunehmend in den Fokus aktueller Forschungen. Trotz der stetig steigenden Zahl wissenschaftlicher Studien ist der Einfluss von Bewirtschaftungsmaßnahmen auf die Diversität dieser Bakteriengemeinschaften in Grünlandökosystemen ver-gleichsweise wenig untersucht. In dieser Studie haben wir neue und interessante Erkenntnisse über die Diversität von Pflanzen-assoziierten Bakterien in Grünlandökosystemen gewonnen. Sämtliche Untersuchungen dieser Arbeit wurden auf der GrassMan-Fläche in den Mittelgebirgslagen des Solling in Deutschland durchgeführt. Das GrassMan-Experiment wurde 2008 in einer Matrix von Wiesenplots schachbrett-artig auf historisch altem Grünland errichtet. Die Bewirtschaftungsintensität unterschied sich bezüglich der Häufigkeiten (einmal jährlich im Juli oder dreimal jährlich im Mai, Juli und September) und der Düngung (keine Düngung bzw. Düngung mit NPK). Außerdem wurde durch gezielten Herbizid-Einsatz gegen Monokotylen oder gegen Dikotylen ein Gradient in der Anzahl der Pflanzenarten erzeugt. Die Arbeit umfasst drei Hauptthemen. Erstens wurde der Einfluss verschiedener Bewirtschaftungsmaßnahmen auf die bakterielle Endophyten-gemeinschaft in den drei Grasarten Festuca rubra, Lolium perenne und Dactylis glomerata untersucht. Hierfür wurden im September 2010 und im April, Juli und September 2011 Pflanzenproben auf den Dikotylen-reduzierten Plots gesammelt. Die Umwelt-DNS wurde aus den Proben extrahiert und als Template für 16S PCRs eingesetzt. Die Struktur der bakteriellen Endophyten-Gemeinschaft wurde mittels DGGE-Analyse der erhaltenen PCR-Produkte untersucht. Wir konnten Unterschiede der Endophyten-Gemeinschaftsstrukturen hinsichtlich der verschiedenen Bewirtschaftungsintensitäten feststellen. Während die Düngung einen starken Effekt auf die bakterielle endophytische Diversität sowohl in F. rubra als auch in L. perenne hatte, wurden die bakteriellen Endo-phyten in D. glomerata nicht dadurch beeinflusst. Die Proben von L. perenne, die von den ungedüngten Plots stammten, bildeten zudem eindeutige Gruppen bei der Analyse der DGGE-Banden bezüglich der zwei Schnitthäufigkeiten. Somit beeinflusste auch die Mahd die bakterielle Endophyten-Gemeinschaft in den Pflanzen. Weiterhin konnten wir einen starken saisonalen Effekt auf die Struktur der endophytischen Gemeinschaft nachweisen. Da saisonale Veränderungen und die Pflanzenart die Zusammensetzung der endophytischen Bakteriengemeinschaft beeinflussten, können sich die Auswirkungen unterschiedlicher Bewirtschaf-tungsintensitäten mit der Zeit und der untersuchten Pflanzenart verändern. Dieses Ergebnis sollte bei zukünftigen Studien berücksichtigt werden. Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, wie sich oberirdische Herbivorie auf die Bakteriengemeinschaft in der Rhizosphäre auswirkt. Hierfür wurde im Herbst 2010 ein Lysimeter-Experiment auf der GrassMan-Fläche errichtet. Nach einer zweiwöchigen Herbivorie durch Grashüpfer und Schnecken im Sommer 2011 wurden Bodenproben von jedem Lysimeter genommen. Um Einblicke in die Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaft in der Rhizosphäre zu erhalten, wurde die Gesamt-DNS aus den Bodenproben extrahiert und als Template in 16S rDNS PCRs eingesetzt. Die Gemeinschaftsstruktur wurde mittels DGGE-Analyse bzw. Pyrosequenzierung der erhaltenen PCR Produkte untersucht. Die Herbivorie hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der Bakterien (richness), während leichte Änderungen in der relativen Abundanz von einigen Bakteriengruppen festgestellt wurden. So war zum Beispiel die relative Abundanz einer unkultivierten Acidobacterium-Art in den Herbivorie-Lysimetern erhöht. Bestandteil des Lysimeter-Experiments war zudem die Untersuchung des Einflusses der Pflanzenartenanzahl und der verschiedenen Bewirtschaftungs-maßnahmen auf die bakterielle Gemeinschaft in der Rhizosphäre. Der Einsatz von Herbiziden und eine niedrigere Schnittfrequenz reduzierten die Artenanzahl (richness) der Bakterien in der Rhizosphäre. Die Düngung hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der Arten. Weitere Analysen zeigten, dass eine Vielzahl von verschiedenen bakteriellen Taxa in der Rhizosphäre durch die untersuchten Maßnahmen beeinflusst wurde. So war die Abundanz der Acidobacteria in den gedüngten Plots signifikant geringer. Das Gegenteil trat bei den Actinobacteria auf. Abschließend lässt sich sagen, dass Pflanzen-assoziierte Bakterien sowohl in der Endosphäre und Rhizosphäre durch Bewirtschaftungsmaßnahmen beeinflusst werden. Die Untersuchung der Wirkung von verschiedenen Bewirtschaftungsintensitäten im Grünland und von oberirdischer Herbivorie auf Pflanzen-assoziierte Bakterien kann zu einem besseren Verständnis der multitrophischen Interaktionen zwischen Pflanzenart, Bakteriengemeinschaft und oberirdischen Herbivoren führen. Außerdem können uns die Ergebnisse dieser Arbeit helfen, die Effekte unterschiedlicher Bewirtschaftungsmaßnahmen auf Pflanzen-assoziierte Bakteriengemeinschaften und damit zusammenhängende Effekte auf das Bodenökosystem vorherzusagen.

Bacterial volatile organic compounds (VOCs) are signal molecules that may have beneficial roles in the soil-plant-microbiome ecosystem. In this Ph.D. thesis, I aimed to assess and characterize the role of bacterial VOCs in plant tolerance to drought and in the biocontrol of fungal pathogens. I started by studying two root endophytic bacteria isolated from pepper plants cultivated under desert farming conditions. They showed an enhancement of pepper tolerance to drought stress and an amelioration of its physiological status. Moreover, they induced the expression of a vacuolar pyrophosphatase proton pump (V-PPase), implicated in the regulation of the vacuolar osmotic pressure, facilitating water uptake. Besides, the exposure of Arabidopsis thaliana plants, grown under salinity stress, to the volatile 2,3-butanediol, described for its plant growth promotion (PGP) potential, enhanced the plants tolerance to salinity, proving the potential involvement of this volatile in the osmotic stress resistance mechanism. Then, I studied VOCs released by three bacteria associated to healthy rice plants. Their released VOCs mixtures modified the color pattern of Magnaporthe oryzae, the agent of the rice blast disease, and protected rice from the pathogen infection. A significant reduction of melanin production, sporulation and appressoria formation was measured in presence of the bacterial VOCs, without major effects on mycelial proliferation. 1-butanol-3-methyl, one of the nine VOCs co-produced by the studied bacteria, proved its potential of reducing M. oryzae melanin in vitro. In vivo tests confirmed the infection inhibition effects mediated by the rice-bacterial VOCs, with a reduction of 94% of the disease incidence. Lastly, I compared the genomes of the five bacteria considered in the previous experimental studies. The PGP traits and the VOCs pathways identified from the genome analyses confirmed the effects observed with the in vitro and in vivo assays, revealing a complex mode of promotion and protection offered by the studied plant-associated bacteria. In conclusion, plant-associated bacterial VOCs can play potentially important roles in modulating plant drought tolerance and reducing fungal virulence. Such biological resources represent novel tools to counteract the deleterious effects of abiotic and biotic stresses and have the potential to be exploited for sustainable approaches in agriculture.

Symbioses between microbes and multicellular eukaryotes are found in all biomes, and encompass a spectrum of symbiotic lifestyles that includes parasitism and disease, commensalism, and mutually beneficial interdependent host-microbe relationships. Regardless of outcome, these symbiotic lifestyles are governed by a complex molecular "courtship" between microbe and potential host. This courtship is the primary determinant of the host range of a given microsymbiont. Host immunity poses a formidable barrier to the establishment of host-microbe relationships, and the majority of microbial suitors will be thwarted by it. Only by successfully "wooing" the host cell's immune defenses with the appropriate molecular signals can a microsymbiont successfully colonize its host. A strategy common to microsymbionts across the spectrum of symbiotic lifestyles and host organisms is the delivery of microbial-encoded effector proteins into the cytoplasm of host cells to manipulate the host cell's molecular machinery for the purposes of subverting host immunity. Bacteria, in particular, have adapted a number of secretion systems for this purpose. The most well-characterized of these is the type III secretion system (T3SS), a molecular apparatus that specializes in injecting type III effector (T3Es) proteins directly into host cells. The work in this thesis focuses on T3Es of plant-associated bacteria, with particular emphasis on mutualistic bacteria. We present evidence that collections of T3Es from Sinorhizobium fredii and Bradyrhizobium japonicum are, in stark contrast to those of phytopathogenic bacteria, in a co-evolutionary equilibrium with their hosts. This equilibrium is characterized by highly conserved T3E collections consisting of many "core" T3Es with little variation in nucleotide sequence. The T3Es of Mesorhizobium loti MAFF303099 suggest a completely different picture of the evolution of T3Es. MAFF303099 recently acquired its T3SS locus, and the work in this thesis provides an evolutionary snapshot of a mutualist that is innovating a T3E collection primarily through horizontal gene transfer. Collectively, this work represents the first comprehensive catalog of T3Es of rhizobia and, in the case of Sinorhizobium and Bradyrhizobium, the first evidence of purifying selection for T3Es. / Graduation date: 2012