Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-07-08T19:29:27Z No. of bitstreams: 1 2010_AlineWelzelGramkowParcial.pdf: 2841617 bytes, checksum: 6d3e8691cd26e3d57ff5f9003c7d61c3 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-07-13T21:46:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AlineWelzelGramkowParcial.pdf: 2841617 bytes, checksum: 6d3e8691cd26e3d57ff5f9003c7d61c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-13T21:46:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AlineWelzelGramkowParcial.pdf: 2841617 bytes, checksum: 6d3e8691cd26e3d57ff5f9003c7d61c3 (MD5) / Os baculovírus compreendem o maior grupo de vírus de insetos estudados no mundo, principalmente pela eficiência em matar pragas da agricultura. Neste trabalho, três baculovírus recombinantes contendo os genes ScathL (Catepsina L) de Sarcophaga peregrina (vSynScathL), Kerat (Queratinase) do fungo Aspergillus fumigatus (vSynKerat) e Quit (Quitinase) do fungo Metarhizium anisopliae (vSynQuit) foram construídos e suas propriedades bioinseticidas analisadas em larvas de Spodoptera frugiperda. Bioensaios em larvas neonatas e de 3º ínstar de S. frugiperda infectadas com os baculovírus vSynScathL, vSynKerat e vSynQuit mostraram uma diminuição no tempo necessário para matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem. O vSynScathL apresentou uma TL50 e TD de 47 horas e 2,62 dias, respectivamente, enquanto o AcMNPV, uma TL50 de 136 horas e TD de 5,37 dias, respectivamente para larvas de S. frugiperda de 3º ínstar. Isso representa uma diminuição significativa de 65,5% para TL50 e 50,09% para TD, no tempo necessário para o vírus matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem. A TL50 e TD para o vírus vSynKerat foi de 91 horas e 3,70 dias, respectivamente, com uma redução de 32,8% para TL50 e 30,21% para TD, no tempo necessário para o vírus matar os insetos infectados quando comparado ao vírus AcMNPV. Já, o vírus recombinante vSynQuit apresentou uma TL50 de 110,67 horas, o que foi 23,6% menor do que o vírus selvagem (TL50 de 144,97). Já em larvas neonatas de S. frugiperda o vSynScathL mostrou uma TL50 de 77 horas comparado ao AcMNPV de 104 horas quando inoculado com 102 corpos de oclusão/nL, já o TD foi de 3,46 dias para o vírus recombinante e 4,16 dias para o AcMNPV. Isso representa uma redução de 26% na TL50 e 16,82% para TD no tempo necessário para matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem AcMNPV. A TL50 do vírus vSynKerat foi de 54 horas, com uma redução de xx 48% comparado ao vírus AcMNPV e o TD de 3,87 dias, reduzindo 6,97% no tempo necessário para matar os insetos; já a TL50 do vírus vSynQuit foi de 86 horas, com uma redução de 45,2% comparado ao vírus selvagem e o TD de 3,75 dias comparado com o vírus selvagem de 4,43 dias, representando uma redução de 15,34% no tempo necessário para matar os insetos. Também mostramos que os vírus vSynScathL e vSynKerat foram capazes de aumentar a atividade de fenoloxidase na hemolinfa de larvas de S. frugiperda em relação ao vírus selvagem e à larva não infectada. A expressão de proteases em larvas infectadas resulta na destruição dos tecidos internos em estágios tardios da infecção, podendo ser uma das razões para o aumento da velocidade para matar as larvas de S. frugiperda, como observado na microscopia eletrônica de varredura para os vírus vSynScathL e vSynKerat em relação ao vírus selvagem e à larva não infectada. O ensaio enzimático com quitina regenerada mostrou também uma diferença quitinolítica significativa em relação aos corpos de oclusão do vírus vSynQuit em comparação ao vírus selvagem. A transcrição de genes celulares em hemócitos derivados de larvas de Anticarsia gemmatalis infectados (12 h p.i.) pelos baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) e/ou Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) também foram analisados neste trabalho pela técnica análise de diferença representacional (RDA). Os trancritos mais abundantes encontrados foram para proteases celulares, que estão provavelmente envolvidas na resposta do inseto à infecção viral. Outros genes, como por exemplo, hsp70 e hsc70, proteínas ribossomais, aminopeptidase, beta 1,3 glicanase, proteína induzida pelo hormônio juvenil, lipase também foram detectados. Todos esses transcritos podem de alguma maneira ter um papel na defesa celular e/ou estabelecimento da infecção viral. Para confirmação dos dados obtidos pela RDA, a transcrição do gene hsc70 foi analisada por PCR em tempo real e confirmou sua expressão diferencial. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculovirus comprise the largest group of insect viruses most studied worldwide, mainly because they efficiently kill agricutural insect pests. In this study, tree recombinant baculoviruses containing the ScathL gene (Cathepsin L) from Sarcophaga peregrina (vSynScathL), the Kerat gene (Keratinase) from the fungus Aspergillus fumigatus (vSynKerat) and Quit gene (Chitinase) from the fungus Metarhizium anisopliae (vSynQuit) were constructed and their insecticidal properties analysed against Spodoptera frugiperda larvae. Bioassays of third-instar and neonate S. frugiperda larvae with vSynScathL,vSynKerat and vSynQuit showed a decrease in the time needed to kill the infected insects when compared to the wild type virus. The vSynScathL showed LT50 and TD of 47 hours and 2.62 days respectively, while AcMNPV, a LT50 of 136 hours and TD of 5.37 days, respectively for third-instar S. frugiperda.larvae. This represents a significant decrease (from 65.5% for LT50 and 50.09% for TD) in the time required to kill the virus infected insects compared to wild virus. The LT50 and TD for vSynKerat was 91 hours and 3.70 days, respectively, showing also a reduction (32.8% for LT50 and 30.21% for TD), in the time required to kill the virus infected insects compared to AcMNPV. Also, the vSynQuit in another bioassay, showed a LT50 of 110.67 hours, which was 23.6% lower than the wild type virus (LT50 of 144.97 hours). Using neonate larvae of S.frugiperda, the vSynScathL showed a LT50 77 hours compared to 104 hours of AcMNPV when inoculated with 102 occlusion bodies/nL, since the TD was 3.46 days for the recombinant virus and 4.16 days for AcMNPV. This represents a 26% reduction in LT50 and 16.82% for TD compared to wild type virus AcMNPV. The LT50 of the virus vSynKerat was 54 hours with a 48% reduction compared to AcMNPV and in the TD of 3.87 days, 6.97%; with vSynQuit the LT50 was 86 hours, with a reduction of 45.2% compared to the wild virus and TD of 3.75 days compared with 4.43 days for wild type virus, a reduction of 15.34%. We have also shown that vSynScathL and vSynKerat were able to increase phenoloxidase activity in the hemolymph of S. frugiperda larvae compared with the wild type virus and with larvae not infected. The expression of proteases in infected larvae resulted in destruction of internal tissues late in infection, which could be the reason for the increased viral speed of kill, as observed in scanning electron microscopy for viruses vSynScathL and vSynKerat compared to the wild type virus and uninfected larvae. The enzyme assay with regenerated chitin also showed a significant chitinolytic difference with occlusion bodies of the vSynQuit compared to wild type virus . The transcription of cellular genes in hemocytes derived from infected larvae of Anticarsia gemmatalis (12 h p.i.) by Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) and/or Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) were also analyzed in this work by the representational difference analysis (RDA). Transcrits more abundants were cellular proteases, which are probably involved in insect response to viral infection. Other genes, such as hsc70 and hsp70, ribosomal proteins, aminopeptidase, beta 1.3 glucanase, protein induced by juvenile hormone, lipase were also detected. All of these transcripts can somehow play a role in cellular defense and/or establishment of viral infection. To confirm the data obtained by RDA, the hsc70 gene transcription was analyzed by real time PCR and confirmed their differential expression.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-11-24T20:14:44Z No. of bitstreams: 1 2015_NayhanneTizzodePaula.pdf: 55124476 bytes, checksum: 8f12f77624a62da5e1daf64f34fe7416 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-12-21T17:18:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_NayhanneTizzodePaula.pdf: 55124476 bytes, checksum: 8f12f77624a62da5e1daf64f34fe7416 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-21T17:18:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_NayhanneTizzodePaula.pdf: 55124476 bytes, checksum: 8f12f77624a62da5e1daf64f34fe7416 (MD5) / Os begomovírus (Família Geminiviridae) compreendem um importante grupo de patógenos de plantas, capazes de infectar um grande número de culturas e causar impacto na agricultura. Esses agentes possuem um genoma constituído por uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, e são transmitidos de maneira persistente e circulativa pela mosca branca (Bemisia tabaci). No Brasil, esses vírus são altamente incidentes e causam grandes danos às culturas do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) e do tomateiro (Solanum lycopersicum). O objetivo desse trabalho foi utilizar a estratégia de RNA de interferência (RNAi) como forma de controle genético de begomoviroses associadas a essas duas culturas. Inicialmente, no caso do feijoeiro, o mecanismo de RNAi foi utilizado para gerar uma linhagem de feijão imune ao bean golden mosaic virus (BGMV). Nós avaliamos se moscas brancas virulíferas, infectadas pelo BGMV, poderiam diminuir sua carga de DNA viral, após se alimentarem em plantas de feijão geneticamente modificadas (GM), que expressam moléculas de pequenos RNAs interferentes (siRNAs), que tem como alvo o gene rep desse vírus. Esse estudo demonstrou que a quantidade de DNA viral foi significativamente reduzida em moscas brancas que se alimentaram em plantas de feijão GM (comparado a moscas que se alimentaram em plantas não- GM), em 52% e 84%, nos períodos de 4 e 8 dias respectivamente. A segunda parte desse trabalho teve como objetivo, avaliar o mecanismo de RNAi como ferramenta na obtenção de plantas de Nicotiana benthamiana transgênicas, com resistência ampla a begomovírus que infectam tomateiro no Brasil. Para isso, um cassete de interferência quimérico - que expressa um haipin RNA (hpRNA) correspondendo ao gene rep de distintas espécies de begomovírus - foi desenvolvido. Os resultados demonstraram que um maior número de plantas transgênicas permaneceram não infectadas, após terem sido desafiadas com uma menor pressão de inóculo do vírus tomato golden vein virus (TGVV) (≈ 250 ng/μL de DNA viral/planta). As plantas transgênicas também foram inoculamos com os vírus tomato rugose mosaic virus (ToRMV), tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) e tomato interveinal chlorosis virus xiii! ! !!!!!!!!! (ToICV), e foi demonstrado que o fenótipo de resistência a esses agentes possivelmente é dependente da zigose do transgene. Uma proporção de 77% das plantas transgênicas, que apresentaram o fenótipo de resistência, demonstraram ser homozigotas. / The begomovirus (Geminiviridae family) are an important group of plant pathogens that cause infection in a large number of crops and impact on agriculture. These agents have one or two molecules of single strand DNA, and are transmitted in a persistent and circulative manner by whitefly (Bemisia tabaci). In Brazil, these viruses have a high incidence and cause great damage to bean (Phaseolus vulgaris) and tomato (Solanum lycopersicum). The aim of this study was to use the molecular tool of RNA interference (RNAi) as a strategy of genetic control of begomovirus associated with these two crops. Initially, with respect to beans, the RNAi mechanism was used to generate a plant line that was immune to the bean golden mosaic virus (BGMV). We investigated if BGMV-viruliferous whiteflies, would reduce DNA viral amount after feeding on genetically modified (GM) bean plants expressing small interfering RNA (siRNAs) molecules, that target rep gene of the virus. This study demonstrated that BGMV DNA amount was significantly reduced in whiteflies feeding on GM-plants (compared with insects feeding on non-GM plants) over a period of 4 and 8 days at 52% and 84% respectively. The second part of this study aimed to evaluate the RNAi mechanism as a tool to obtain transgenic Nicotiana benthamiana plants with wide resistance to begomovirus infecting tomato in Brazil. For this, a chimeric cassete of interference - that expresses an intron-hairpin RNA (hpRNA) directed to the rep gene of different species of begomoviruses - was developed. The results showed that a higher number of transgenic plants remained uninfected after being challenged with a lower infection pressure of tomato golden vein virus virus (TGVV) (≈ 250 ng/μL viral DNA/plant). Transgenic plants were also inoculated with tomato rugose mosaic virus (ToRMV), tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) and tomato interveinal chlorosis virus (ToICV), and was demonstrated that phenotype resistance to these agents is possibly dependent on transgene zygosis. A proportion of 77% of the transgenic plants that showed resistance phenotype, proved to be homozygous.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-03-21T13:05:26Z No. of bitstreams: 1 2014_PablineMarinhoVieira_Parcial.pdf: 10665470 bytes, checksum: f1332eb503825366aa2631b295e58808 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-03-21T13:45:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_PablineMarinhoVieira_Parcial.pdf: 10665470 bytes, checksum: f1332eb503825366aa2631b295e58808 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T13:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_PablineMarinhoVieira_Parcial.pdf: 10665470 bytes, checksum: f1332eb503825366aa2631b295e58808 (MD5) / Trichoderma harzianum é um microorganismo de controle biológico eficaz contra várias espécies de patógenos de plantas. Dentre estes, Fusarium solani é um importante causador de prejuízos econômicos na agricultura. Nesse trabalho, através de bibliotecas subtrativas (SSH) e RT-PCR tempo real, foram identificados genes de T. harzianum que estão envolvidos no controle biológico deste fitopatógeno. A análise comparativa de respostas transcricionais em Trichoderma harzianum permitiu uma interpretação abrangente do micoparasitismo, identificou genes marcadores para o biocontrole, e principalmente, de interesse biotecnológico na agricultura. Como os desafios em biotecnologia agrícola incluem identificar genes para estratégias de resistência a estresses bióticos e abióticos em plantas, uma aquaporina identificada nesta biblioteca foi utilizada para a transformação genética de Trichoderma harzianum e Nicotianatabacum (tabaco). Organismos geneticamente modificados com o gene codificador de uma aquaporina foram avaliados em diferentes condições de estresses abióticos (etanol, peróxido de hidrogênio, polietileno-glicol, sorbitol e cloreto de sódio) e biótico (Fusarium solani). Em condições ótimas de crescimento, não foram observadas alterações na germinação ou crescimento em T. harzianum e tabaco. Em ensaios de tolerância a Fusarium solani, linhagens de plantas geneticamente modificadas não apresentaram resistência ao fitopatógeno. Entretanto, nas condições de estresse abióticos avaliadas, aquaporina aumentou a tolerância a estresse salino em ambos os organismos transformados. Sendo assim, nossos resultados confirmam o elevado potencial de T. harzianum como fonte de genes com aplicações promissoras em plantas transgênicas resistentes a estresses abióticos sem alteração fenotípica. / Trichoderma harzianum, a filamentous soil fungus, is an effective biocontrol agent against many plant-pathogen species. Despite its relevance in plant protection, there is a lack of studies concerning its use as a biological control agent against Fusarium solani, which is involved in several crop diseases. In order to provide information about the genes from T. harzianum that are involved in the biocontrol of this pathogen, we have used subtractive library hybridization (SSH) and RT-PCR techniques. Transcriptional responses in Trichoderma harzianum allowed a comprehensive interpretation of my coparasitism, identified biocontrol-related genes, and also genes of biotechnological value. Following its identification in our library, a gene encodinganaquaporinhasbeenusedtoenhancetolerancetobioticandabioticstresses in both Trichoderma harzianum and Nicotiana tabacum plants. Transformants were selected and evaluated underdifferent abiotic (ethanol, hydrogen peroxide, polyethyleneglycol, sorbitol and sodium chloride) andbiotic (Fusarium solani) stresses. Analysis under stress-free condition showed that both Trichoderma harzianum and to bacco plants transformed with aquaporin did not present differences in growth and germination rates when compared with wild type. Furthermore, potential tolerance against Fusarium solani was assessed in plants by challeng in gleaves with the pathogen and no tolerance was observed in all lines tested. However, evaluations under abiotic stresses revealed that both organisms presented tolerance to salt stresses. Our results under scorethe high potential of T. harzianum as a sourceof genes with promising applications in transgenic plants resistant to abiotic stresses without phenotypic alteration.