Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-06-07T18:21:24Z No. of bitstreams: 1 TESE Túlio Diego da Silva.pdf: 994215 bytes, checksum: acfdd83af6a4a6d93c9d4aeb6d797d0b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T18:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Túlio Diego da Silva.pdf: 994215 bytes, checksum: acfdd83af6a4a6d93c9d4aeb6d797d0b (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / A fusariose é uma das doenças mais importantes do tomateiro (Solanum lycopersicum L.). Ela é causada pelo fungo de solo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) e causa elevadas perdas na agricultura, pois o controle químico não é eficiente. Entender a interação planta-patógeno é a chave para o manejo da doença e o melhor guia para os programas de melhoramento. A maior parte da interação entre o patógeno e o hospedeiro ocorre através de proteínas de reconhecimento, sinalização ou das respostas desencadeadas. Assim, este estudo propôs avaliar as alterações no proteoma da raiz do tomateiro infectado com Fol, através da eletroforese bidimensional (2-DE), marcação com iTRAQ e espectrometria de massas. Foram utilizadas a cultivar BHRS 2,3 (resistente) e Viradouro (suscetível), além de um isolado da raça 3 de Fol, introduzido recentemente no país, tendo assim, poucas cultivares resistentes. Após 21 dias de crescimento, raízes foram cortadas, inoculadas com suspensão de esporos do patógeno e coletadas nos tempos um, quatro e sete dias após a inoculação. As proteínas foram extraídas, quantificadas, separadas por 2-DE, analisadas por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF/TOF e identificadas com a ferramenta MASCOT. Os extratos protéicos também foram digeridos com tripsina, marcados com iTRAQ, fracionados e dessalinizados. A LC-MS/MS foi feita através do cromatógrado UPLC Dyonex 3000 com aquisição dos espectros realizada através do Orbitrap Elite. Quatro dias após a inoculação, 21 proteínas separadas por 2-DE mostraram-se diferencialmente reguladas na cultivar BHRS 2,3. 12 com aumento de expressão e nove sub reguladas. Após sete dias de inoculação, a cultivar Viradouro apresentou 204 proteínas com expressão diferencial, 93 proteínas reguladas positivamente e 111 proteínas reguladas negativamente. Além disso, foi possível identificar 41 proteínas do fungo. Não houveram proteínas reguladas com consistência estatística na cultivar resistente. Com 24 horas após a inoculação houve a regulação de seis proteínas na cultivar BHRS 2,3. Das proteínas reguladas após 24h, destaca-se a proteína de membrana remorina, relacionada à percepção de patógenos e nunca relatada no patossistema tomateiro/Fol. Após quatro dias, várias proteínas de defesa apresentaram aumento de expressão na cultivar resistente. Com sete dias de infecção, proteínas relacionadas com a defesa da cultivar Viradouro apresentaram diminuição na expressão, proteínas de reconhecimento de fungos, de sinalização e relacionadas a patogenicidade são exemplos. Além disso, várias proteínas ribossomais também estavam reguladas negativamente, prejudicando a síntese global de proteínas. Entre as proteínas com aumento de expressão, destacam-se proteínas relacionadas com explosão oxidativa, evento da reação de hipersensibilidade, um mecanismo de defesa da planta. Em relação às proteínas do fungo observadas, a maior parte está relacionada ao desenvolvimento e proteínas estruturais. Entretanto, a enzima 4-coumarate-ligase-like 9, relacionada a síntese do ácido jasmônico, pode indicar influência do fungo na biologia da planta. Os resultados evidenciaram diversas proteínas ativadas e desativadas durante a interação do tomateiro com o Fol, onde pode-se observar a dinâmica entre o ataque do fungo e as defesas da planta. Além disso, o aumento da expressão da remorina, nunca antes descrita nesse patossistema, pode contribuir com futuros estudos de manejo da fusariose. / The Fusarium wilt is one of the most important diseases in tomato cultivation (Solanum lycopersicum L.) around the world. It is caused by soil fungus Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) and annually causes great losses to agriculture since chemical control is inefficient. Understanding the plant-pathogen interaction is the key to better handling the infection and it’s the best guide for genetic enhancement programs. The greater part of the host-pathogen interaction is done through proteins, those being recognizing, signaling or triggered responses. Therefore, this paper proposes to evaluate the alterations to Fol-infected tomato root proteome through two-dimensional electrophoresis (2-DE), iTRAQ marking and mass spectrometry. BHRS 2,3 (resistant) and Viradouro (susceptible) cultivars were used, as well as an isolate of Fol race 3 for being recently introduced in the country, thus having few resistant tomato cultivars. After 21 days of growth, roots were cut, inoculated with a pathogen spore suspension and collected after one, four and seven days of inoculation. Proteins were extracted, quantified, separated by 2-DE, analyzed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry and identified by MASCOT tool. Protein extracts were also digested with trypsin, marked with iTRAQ, fractioned and desalinized. LC-MS/MS was done through UPLC Dyonex 3000 chromatograph and specter acquisition was done via Orbitrap Elite. Four days after inoculation, 21 proteins separated by 2-DE turned up to be differentially regulated in cultivar BHRS 2,3, 12 with increased expression and nine sub regulated. After seven days of inoculation, cultivar Viradouro showed 204 proteins with differential expression, 93 of which positively regulated and 111 negatively. In addition, it was possible to identify 41 fungus proteins. There were no regulated proteins with statistic consistence in cultivar BHRS 2,3. After 24h of inoculation there was regulation of six proteins in cultivar BHRS 2,3. From the proteins regulated after 24h, remorin membrane protein stands out, since it is related to pathogen perception and had never been reported in tomato/Fol pathosystem. After four days, several defense proteins showed increased expression in the resistant cultivar. With seven days of infection, several defense related proteins from cultivar Viradouro showed a decrease in expression, with fungus recognition proteins, signaling proteins and proteins related to pathogenicity as examples. Furthermore, numerous ribosomal proteins were also negatively regulated, impairing global protein synthesis. Standing out between the proteins with increased expression were proteins related to oxidative explosion, an event component to the hypersensitivity reaction, which is one of the plant’s main defense mechanisms. With regard to fungus proteins observed in the susceptible cultivar, most of those are related to growth and structural proteins. But enzyme 4-coumarate-ligase-like 9 related to jasmonic acid synthesis may suggest fungal influence in the plant’s biology. Results revealed several active and deactivated proteins during the tomato plant’s interaction with Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici fungus, where the dynamic between the fungus attack and plant defenses can be seen. Moreover, the increase in expression of remorin, never before described in the pathosystem, may contribute to future studies in handling Fusarium wilt.