Mycoplasmas are responsible for many important diseases of animals, including contagious bovine pleuropneumonia (CBPP) caused by Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC and calf pneumonia, arthritis and mastitis caused by Mycoplasma bovis. However, diagnostic techniques currently available are laborious and imprecise. The work described in this thesis concentrates on the critical evaluation of existing techniques and the development of improved procedures. The role of antimicrobial resistance in limiting the options for disease control was also considered. Diagnostic methods for the detection of M. mycoides subsp. mycoides SC in clinical material were critically evaluated during a CBPP outbreak in Portugal. Immunoblotting was more sensitive and specific than CFT or ELISA. The polymerase chain reaction (PCR) was more rapid and sensitive than culture. However immunocytohistochernistry (ICC) was far the best test for detecting M. mycoides subsp. mycoides SC antigen in lungs. A rapid latex agglutination test (LAT) to detect CBPP using a carbohydrate extract of M. mycoides subsp. mycoides SC was developed. Analysis of the carbohydrate extract composition demonstrated that fucose, glucosamine and galactose are present in the ratio of 1:2:16 respectively. N-acetyl neuraminic acid was also detected. Evaluation of the LAT with sera from negative, naturally infected and experimentally infected cattle demonstrates that the test clearly differentiates positive and negative CBPP sera. The LAT compared favourably with the CFT but was not as specific as the immunoblotting; however the LAT had the advantage of being more rapid and robust and could be used in the field. Molecular methods including the polymerase chain reaction (PCR) and 16S rRNA gene sequencing were assessed for their potential use in the diagnostic laboratory. A PCR method for identifying M. bovis was adapted, evaluated and introduced as a routine laboratory test. Using a set of universal 16S rRNA gene primers, amplicons of two serologically untypable isolates, one from a peregrine falcon, and the other from an ostrich were obtained. Results imply that the isolates may be new mycoplasma species. The development of antimicrobial resistance has been seen in many microorganisms but little evidence exists for resistance in mycoplasmas. Consequently, the in vitro effect of five antimicrobials; danofloxacin, oxytetracycline, spectinomycin, florfenicol and tilmicosin on 62 isolates of M. bovis and 20 of M. mycoides subsp. mycoides SC was investigated. Nfinimum inhibitory concentrations (MICs) and mycoplasmacidal (MMC) values were determined. Evidence of antimicrobial resistance by M. bovis is shown. The potential for M. mycoides subsp. mycoides SC to develop antimicrobial resistance against spectinomycin in vitro is also demonstrated.

Thesis--Københavns universitet. / Bibliography: p. [130]-141.

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Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, enfermidade amplamente distribuída no rebanho suíno mundial, responsável por prejuízos econômicos relevantes. Possui 12 sorotipos, determinados por técnicas de sorotipificação. Além disso é descrita a ocorrência de amostras não sorotipificáveis. O conhecimento do sorotipo prevalente nos surtos da enfermidade é necessário aos programas de profilaxia. Procurando contornar as dificuldades normalmente encontradas na sorotipificação de A. pleuropneumpnoae, a técnica de RAPD foi avaliada na genotipificação de amostras sorotipificáveis e não sorotipificáveis do agente. Foram utilizados amostras ATCC dos 12 sorotipos e amostras dos sorotipos, 1, 3, 5a, 5b, 7, 11 e 12 isolados no Brasil. Os primers OPG e OPG-19, utilizados individualmente nas reações, foram mais adequados para a diferenciação dos sorotipos. O primer OPG-19 detectou polimorfismos semelhantes entrer os sorotipos 1, 3, 4, 5 e 11; e sorotipos 7 e 12. O perfil de RAPD detectado pelo primier OPGF-10 diferenciou os isolados de campo dos sorotipos 1, 7, 11 e 12. Os sorotipos 3 e 5 apresentaram padrão de RAPD semelhantes, sendo diferenciados pelo perfil de exotoxinas característico, determinado previamente através de PCR. Este primer identificou quatro diferentes perfis de RAPD no sorotipo 3. Um destes foi semelhante ao obtido como sorotipo 11. Neste isolado, foi detecta a presença dos genes para ApxI e ApxII, características do sorotipo 11. As amostras do sorotipo 4 apresentaram perfil de RAPD semelhante ao identificado nos sorotipos 3 ou 5 com o primeir OPG-10, sendo identificada, por PCR, a presença dos genes para ApxI e ApxI, os quais não são característicos do sorotipo. Estas amostras foram isoladas em anos posteriores à amostras dos sorotipos 3 e 5 analisadas. Foi possível caracterizar 14 das 14 amostras não sorotipificáveis de A.pleuropneumpniae obtidas de suínos com sinais da doença. Entre as 4 amostras não sorotipificáveis isoladas de leitões sem sinais clínicos, apenas uma foi caracterizada através de RAPD. É possível que as demais amostras sejam outrtas bactérias NAD-dependente isoladas do trato respiratório de suínos. Amostras caracterizadas como A. minor e A. indolicus apresentaram perfis de RAPD divergentes dos identificados em isolados puros de A. pleuropneumoniae, comprovando a capacidade da técnica na caracterização do agente. Diferentes amostras do mesmo sorotipo de A. pleuropneumoniae apresentaram polimorfismos de RAPD idênticos, demonstrando reprodutividade da técnica. Os resultados comprovam a capacidade de tipificação de A. Pleuropneumoniae através de RAPD. A pesquisa de primers adequados para a diferenciação dos sorotipos 3, 4 e 5 aprimorar sua caracterização, o que pode vir a contribuir com as técnicas de sorotipificação tradicionalmente utilizados, ou permitir o uso como método de confirmação nas amostras cuja sorotipificação é problemática.

Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, enfermidade amplamente distribuída no rebanho suíno mundial, responsável por prejuízos econômicos relevantes. Possui 12 sorotipos, determinados por técnicas de sorotipificação. Além disso é descrita a ocorrência de amostras não sorotipificáveis. O conhecimento do sorotipo prevalente nos surtos da enfermidade é necessário aos programas de profilaxia. Procurando contornar as dificuldades normalmente encontradas na sorotipificação de A. pleuropneumpnoae, a técnica de RAPD foi avaliada na genotipificação de amostras sorotipificáveis e não sorotipificáveis do agente. Foram utilizados amostras ATCC dos 12 sorotipos e amostras dos sorotipos, 1, 3, 5a, 5b, 7, 11 e 12 isolados no Brasil. Os primers OPG e OPG-19, utilizados individualmente nas reações, foram mais adequados para a diferenciação dos sorotipos. O primer OPG-19 detectou polimorfismos semelhantes entrer os sorotipos 1, 3, 4, 5 e 11; e sorotipos 7 e 12. O perfil de RAPD detectado pelo primier OPGF-10 diferenciou os isolados de campo dos sorotipos 1, 7, 11 e 12. Os sorotipos 3 e 5 apresentaram padrão de RAPD semelhantes, sendo diferenciados pelo perfil de exotoxinas característico, determinado previamente através de PCR. Este primer identificou quatro diferentes perfis de RAPD no sorotipo 3. Um destes foi semelhante ao obtido como sorotipo 11. Neste isolado, foi detecta a presença dos genes para ApxI e ApxII, características do sorotipo 11. As amostras do sorotipo 4 apresentaram perfil de RAPD semelhante ao identificado nos sorotipos 3 ou 5 com o primeir OPG-10, sendo identificada, por PCR, a presença dos genes para ApxI e ApxI, os quais não são característicos do sorotipo. Estas amostras foram isoladas em anos posteriores à amostras dos sorotipos 3 e 5 analisadas. Foi possível caracterizar 14 das 14 amostras não sorotipificáveis de A.pleuropneumpniae obtidas de suínos com sinais da doença. Entre as 4 amostras não sorotipificáveis isoladas de leitões sem sinais clínicos, apenas uma foi caracterizada através de RAPD. É possível que as demais amostras sejam outrtas bactérias NAD-dependente isoladas do trato respiratório de suínos. Amostras caracterizadas como A. minor e A. indolicus apresentaram perfis de RAPD divergentes dos identificados em isolados puros de A. pleuropneumoniae, comprovando a capacidade da técnica na caracterização do agente. Diferentes amostras do mesmo sorotipo de A. pleuropneumoniae apresentaram polimorfismos de RAPD idênticos, demonstrando reprodutividade da técnica. Os resultados comprovam a capacidade de tipificação de A. Pleuropneumoniae através de RAPD. A pesquisa de primers adequados para a diferenciação dos sorotipos 3, 4 e 5 aprimorar sua caracterização, o que pode vir a contribuir com as técnicas de sorotipificação tradicionalmente utilizados, ou permitir o uso como método de confirmação nas amostras cuja sorotipificação é problemática.

Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, enfermidade amplamente distribuída no rebanho suíno mundial, responsável por prejuízos econômicos relevantes. Possui 12 sorotipos, determinados por técnicas de sorotipificação. Além disso é descrita a ocorrência de amostras não sorotipificáveis. O conhecimento do sorotipo prevalente nos surtos da enfermidade é necessário aos programas de profilaxia. Procurando contornar as dificuldades normalmente encontradas na sorotipificação de A. pleuropneumpnoae, a técnica de RAPD foi avaliada na genotipificação de amostras sorotipificáveis e não sorotipificáveis do agente. Foram utilizados amostras ATCC dos 12 sorotipos e amostras dos sorotipos, 1, 3, 5a, 5b, 7, 11 e 12 isolados no Brasil. Os primers OPG e OPG-19, utilizados individualmente nas reações, foram mais adequados para a diferenciação dos sorotipos. O primer OPG-19 detectou polimorfismos semelhantes entrer os sorotipos 1, 3, 4, 5 e 11; e sorotipos 7 e 12. O perfil de RAPD detectado pelo primier OPGF-10 diferenciou os isolados de campo dos sorotipos 1, 7, 11 e 12. Os sorotipos 3 e 5 apresentaram padrão de RAPD semelhantes, sendo diferenciados pelo perfil de exotoxinas característico, determinado previamente através de PCR. Este primer identificou quatro diferentes perfis de RAPD no sorotipo 3. Um destes foi semelhante ao obtido como sorotipo 11. Neste isolado, foi detecta a presença dos genes para ApxI e ApxII, características do sorotipo 11. As amostras do sorotipo 4 apresentaram perfil de RAPD semelhante ao identificado nos sorotipos 3 ou 5 com o primeir OPG-10, sendo identificada, por PCR, a presença dos genes para ApxI e ApxI, os quais não são característicos do sorotipo. Estas amostras foram isoladas em anos posteriores à amostras dos sorotipos 3 e 5 analisadas. Foi possível caracterizar 14 das 14 amostras não sorotipificáveis de A.pleuropneumpniae obtidas de suínos com sinais da doença. Entre as 4 amostras não sorotipificáveis isoladas de leitões sem sinais clínicos, apenas uma foi caracterizada através de RAPD. É possível que as demais amostras sejam outrtas bactérias NAD-dependente isoladas do trato respiratório de suínos. Amostras caracterizadas como A. minor e A. indolicus apresentaram perfis de RAPD divergentes dos identificados em isolados puros de A. pleuropneumoniae, comprovando a capacidade da técnica na caracterização do agente. Diferentes amostras do mesmo sorotipo de A. pleuropneumoniae apresentaram polimorfismos de RAPD idênticos, demonstrando reprodutividade da técnica. Os resultados comprovam a capacidade de tipificação de A. Pleuropneumoniae através de RAPD. A pesquisa de primers adequados para a diferenciação dos sorotipos 3, 4 e 5 aprimorar sua caracterização, o que pode vir a contribuir com as técnicas de sorotipificação tradicionalmente utilizados, ou permitir o uso como método de confirmação nas amostras cuja sorotipificação é problemática.

Four strains of the swine pathogen Actinobacillus pleuropneumoniae, namely, the type strain (ATCC 27088), the "reference" strain of biotype 2 (Bertschinger 2008/76) and two additional biotype 1 strains, strain BC181, which is less virulent than the type strain, and strain K17 (reference strain of serotype 5A), which was isolated from a lamb, were investigated with respect to iron acquisition. All four strains produced iron-repressible outer membrane proteins. However, only strains ATCC 27088 and Bertschinger 2008/76 could acquire iron from porcine transferrin. No organism could utilize human, bovine or ovine transferrin, or ovine or porcine lactoferrin. Haemoglobin supported good growth of all strains except K17 (which also failed to acquire iron from haemin). In all cases, iron acquisition from transferrin or haemoglobin required direct contact between the organisms and the proteins. Total membranes derived from iron-restricted organisms were subjected to an affinity isolation technique based on biotinylated porcine transferrin and streptavidin-agarose, and the following polypeptides were isolated: 99 kDa and 64 kDa from strain ATCC 27088; 93 kDa from strain Bertschinger 2008/76; 95 kDa (trace amounts) and 60 kDa from strain BC181; none from strain K17. These polypeptides appear to be transferrin receptor components. The 99 kDa polypeptide (TBPl) from the type strain was purified by SDS-PAGE and transferred electrophoretically onto polyvinylidene difluoride membrane. The N-terminal amino acid sequence of the polypeptide was determined commercially. A commercially-synthesized oligonucleotide probe was used to clone the gene encoding the TBPl of the type strain in competent Escherichia coli DH5$ alpha$ cells.

Contagious caprine pleuropneumonia (CCPP) is a highly contagious disease that affects goats in Africa and Asia resulting in great economic losses. The aetiological agent is Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae (Mccp). It belongs to a group of organisms that are all associated with economically important diseases of ruminants and all exhibit similar genetic and antigenic characteristics. The diagnosis of CCPP has often been considered difficult due to confusion with other mycoplasmas of ruminants and the limited specificity of most diagnostic assays. It is therefore important to improve diagnosis and thereby the control of CCPP. Two approaches, namely phage display and anti-idiotype antibodies can be used to identify antigenic mimics with the potential to be used in developing new vaccines, diagnostic methods or therapeutics. Both were used in an attempt to generate surrogate antigens for Mccp. A monoclonal antibody (Mab) or its F( ab ')2 fragments directed against Mccp membrane protein epitopes was injected into hens to induce the production of anti-idiotype antibodies. The antibodies produced were functionally able to mimic the epitope recognised by the Mab since they inhibited binding of the Mab to mycoplasmal lysate. Mice were also immunised with the Mab and or F(ab') 2 fragments of the antibody. The resulting antisera were tested in ELISA, but no significant response was detected. The selection of peptides from a random epitope library displayed on the surface of filamentous phages was used to characterise the epitope recognised by the Mab. Two different, but related peptides were identified that reacted with the antibody in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Binding to the Mab was further characterised by surface plasmon resonance. Sequence analysis revealed that the two peptides each had a cysteine residue in addition to the one fixed in amino acid position 2 as well as identical or similar amino acid residues in positions 5 (P), 8 (I/L) and 13 (L). One of the peptides had 74% similarity with an amino acid sequence of the PG 1 strain of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC. The peptides as well as the anti-idiotype antibodies were not detectable using Mccp-specific goat antiserum suggesting that the serum did not contain paratopes that could accommodate the surrogate epitopes. In spite of this, the antiserum efficiently inhibited the binding of the Mab to immobilised mycoplasmal lysate in a standardised test for Mccp antibodies. This assay therefore appears to depend on a structural, rather than a functional blocking of the epitope which the Mab recognises. The findings in this study have elucidated some of the characteristics of the Mab and raised the possibility that the epitope recognised by the Mab is not immunodominant. Peptides identified by phage display and chicken/murine anti-idiotype antibodies, nevertheless, have the potential of being used as antigens in immunoassays aimed at CCPP diagnosis. In light of the results generated it would therefore be necessary to investigate other Mabs or polyclonal antiserum in order to yield antibodies or peptides of the desired specificity. / Dissertation (MSc (Microbiology))--University of Pretoria, 2007. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted