O Brasil é o maior produtor de laranja do mundo, liderando também a produção e exportação de suco concentrado congelado. Um dos fatores que ameaçam o setor é o grande número de doenças, principalmente, as bacterianas como o Huanglongbing (HLB). O HLB é considerado uma das mais graves doenças dos citros, que compromete seu desenvolvimento e produção, podendo levar à morte das plantas afetadas. Os agentes associados a esta doença são bactérias endógenas restritas ao floema (Candidatus Liberibacter spp.). No gênero Citrus, ainda não foram encontradas espécies resistentes ao HLB, o que tem estimulado a utilização de ferramentas biotecnológicas, como a transformação genética, para auxiliar os programas de melhoramento genético, nos quais genes de interesse agronômico são introduzidos visando resistência a doenças. Na busca por uma planta transgênica resistente ao HLB, é desejável obter construções gênicas nas quais o gene de interesse se expresse, preferencialmente, na região em que a bactéria coloniza a planta, ou seja, no caso do HLB, no floema. Este trabalho objetivou avaliar plantas transgênicas de citrange \'Carrizo\' [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] com gene uidA (β-glucuronidase), dirigido pelos promotores dos genes CsPP2.1 (Phloem protein 2) e CsVTE2 (homogentisato fitiltransferase) obtidos de Citrus sinensis. Foram analisadas as especificidades de cada promotor, e estes foram comparados com a ação do promotor constitutivo CaMV35S. Análises moleculares, como Southern blot e qPCR, foram realizadas a fim de verificar o número de cópias do transgene em cada planta avaliada, e quantificar a expressão relativa do gene uidA dirigido pelos diferentes promotores, respectivamente. Análises histológicas foram feitas para verificar a localização da expressão do gene repórter GUS (uidA). A expressão relativa do gene uidA dirigido pelos promotores específicos foi mais baixa quando comparada com o promotor constitutivo CaMV35S, uma vez que estes promotores direcionam a expressão apenas para tecidos específicos. O promotor CsPP2.1 direcionou a expressão do gene uidA para o tecido floemático, mais especificamente junto às células companheiras e elementos de tubo crivado. O promotor CsVTE2 direcionou a expressão do gene repórter preferencialmente para a periferia do parênquima cortical e para as células guarda, o que corresponde às áreas com presença de cloroplastos, além de também direcionar a expressão para o tecido floemático. Apesar de não ser específico de floema, o promotor CsVTE2 constitui-se em uma boa alternativa para construções visando o combate a doenças vasculares por estar envolvido em importantes processos fisiológicos da planta, como o combate a estresses oxidativos e o carregamento de fotoassimilados no floema. Os resultados sugerem que CsPP2.1 e CsVTE2 são promotores potenciais para serem utilizados em construções gênicas visando o controle de doenças vasculares tais como o HLB. / Brazil is the world\'s largest sweet orange producer, leading also the export of frozen concentrated orange juice. However, the citrus industry is constantly threatened by diseases, particularly those caused by bacteria, such as Huanglongbing (HLB). HLB is considered one of the most harmful citrus diseases, leading the plants to their death. The associated agents of this disease are endogenous bacteria restricted to the phloem of the plants (Candidatus Liberibacter spp.). No resistance has been found in Citrus spp. that could be used in breeding programs. Therefore, biotechnological strategies, such as genetic transformation, could help such programs to introduce genes for disease resistance. It is desirable the use of gene constructs that are preferentially expressed where the bacterium colonizes the plant, i.e., the phloem in plants affected by HLB. This study aimed to evaluate transgenic plants of \'Carrizo\' citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] with uidA gene (β-glucuronidase), driven by the promoters of CsPP2.1 (Phloem protein 2) and CsVTE2 (homogentisato fitiltransferase) genes obtained from Citrus sinensis plants. Each promoter specificity was analyzed and gene expression was compared with that induced by the constitutive promoter CaMV35S. Molecular analyses such as Southern blot and qPCR were performed in order to verify the number of transgenic copies in plants and to quantify relative expression of the uidA gene driven by different promoters, respectively. Histological analyses were done in order to identify the exact location of the GUS (uidA) reporter gene expression. Relative expressions of the uidA gene driven by specific promotors were lower than that driven by the CaMV35S constitutive promoter, since the expression was limited to specific tissues. The CsPP2.1 promoter drove the uidA gene expression to the phloem tissue, specifically to the companion cells and sieve elements. On the other hand, CsVTE2 promoter drove the reporter gene expression mainly to the periphery of the cortical parenchyma and to the guard cells, where high number of chloroplasts were present, and also drove the expression to the phloem. Although the CsVTE2 promoter is not phloem-specific, it might be used in gene constructs aiming vascular disease control, since it is involved in physiological processes such as mitigating oxidative stress and photoassimilate phloem loading. The results suggest that CsPP2.1 e CsVTE2 are promising promoters to be used in gene constructs in order to control vascular diseases, such as HLB.

O Brasil é o maior produtor de laranja do mundo, liderando também a produção e exportação de suco concentrado congelado. Um dos fatores que ameaçam o setor é o grande número de doenças, principalmente, as bacterianas como o Huanglongbing (HLB). O HLB é considerado uma das mais graves doenças dos citros, que compromete seu desenvolvimento e produção, podendo levar à morte das plantas afetadas. Os agentes associados a esta doença são bactérias endógenas restritas ao floema (Candidatus Liberibacter spp.). No gênero Citrus, ainda não foram encontradas espécies resistentes ao HLB, o que tem estimulado a utilização de ferramentas biotecnológicas, como a transformação genética, para auxiliar os programas de melhoramento genético, nos quais genes de interesse agronômico são introduzidos visando resistência a doenças. Na busca por uma planta transgênica resistente ao HLB, é desejável obter construções gênicas nas quais o gene de interesse se expresse, preferencialmente, na região em que a bactéria coloniza a planta, ou seja, no caso do HLB, no floema. Este trabalho objetivou avaliar plantas transgênicas de citrange \'Carrizo\' [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] com gene uidA (β-glucuronidase), dirigido pelos promotores dos genes CsPP2.1 (Phloem protein 2) e CsVTE2 (homogentisato fitiltransferase) obtidos de Citrus sinensis. Foram analisadas as especificidades de cada promotor, e estes foram comparados com a ação do promotor constitutivo CaMV35S. Análises moleculares, como Southern blot e qPCR, foram realizadas a fim de verificar o número de cópias do transgene em cada planta avaliada, e quantificar a expressão relativa do gene uidA dirigido pelos diferentes promotores, respectivamente. Análises histológicas foram feitas para verificar a localização da expressão do gene repórter GUS (uidA). A expressão relativa do gene uidA dirigido pelos promotores específicos foi mais baixa quando comparada com o promotor constitutivo CaMV35S, uma vez que estes promotores direcionam a expressão apenas para tecidos específicos. O promotor CsPP2.1 direcionou a expressão do gene uidA para o tecido floemático, mais especificamente junto às células companheiras e elementos de tubo crivado. O promotor CsVTE2 direcionou a expressão do gene repórter preferencialmente para a periferia do parênquima cortical e para as células guarda, o que corresponde às áreas com presença de cloroplastos, além de também direcionar a expressão para o tecido floemático. Apesar de não ser específico de floema, o promotor CsVTE2 constitui-se em uma boa alternativa para construções visando o combate a doenças vasculares por estar envolvido em importantes processos fisiológicos da planta, como o combate a estresses oxidativos e o carregamento de fotoassimilados no floema. Os resultados sugerem que CsPP2.1 e CsVTE2 são promotores potenciais para serem utilizados em construções gênicas visando o controle de doenças vasculares tais como o HLB. / Brazil is the world\'s largest sweet orange producer, leading also the export of frozen concentrated orange juice. However, the citrus industry is constantly threatened by diseases, particularly those caused by bacteria, such as Huanglongbing (HLB). HLB is considered one of the most harmful citrus diseases, leading the plants to their death. The associated agents of this disease are endogenous bacteria restricted to the phloem of the plants (Candidatus Liberibacter spp.). No resistance has been found in Citrus spp. that could be used in breeding programs. Therefore, biotechnological strategies, such as genetic transformation, could help such programs to introduce genes for disease resistance. It is desirable the use of gene constructs that are preferentially expressed where the bacterium colonizes the plant, i.e., the phloem in plants affected by HLB. This study aimed to evaluate transgenic plants of \'Carrizo\' citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] with uidA gene (β-glucuronidase), driven by the promoters of CsPP2.1 (Phloem protein 2) and CsVTE2 (homogentisato fitiltransferase) genes obtained from Citrus sinensis plants. Each promoter specificity was analyzed and gene expression was compared with that induced by the constitutive promoter CaMV35S. Molecular analyses such as Southern blot and qPCR were performed in order to verify the number of transgenic copies in plants and to quantify relative expression of the uidA gene driven by different promoters, respectively. Histological analyses were done in order to identify the exact location of the GUS (uidA) reporter gene expression. Relative expressions of the uidA gene driven by specific promotors were lower than that driven by the CaMV35S constitutive promoter, since the expression was limited to specific tissues. The CsPP2.1 promoter drove the uidA gene expression to the phloem tissue, specifically to the companion cells and sieve elements. On the other hand, CsVTE2 promoter drove the reporter gene expression mainly to the periphery of the cortical parenchyma and to the guard cells, where high number of chloroplasts were present, and also drove the expression to the phloem. Although the CsVTE2 promoter is not phloem-specific, it might be used in gene constructs aiming vascular disease control, since it is involved in physiological processes such as mitigating oxidative stress and photoassimilate phloem loading. The results suggest that CsPP2.1 e CsVTE2 are promising promoters to be used in gene constructs in order to control vascular diseases, such as HLB.

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Ela está presente no país, nos estados de São Paulo, Paraná e Minas Gerais e causa sérios prejuízos à citricultura. Até o momento não há medidas curativas eficientes no controle do HLB, portanto a verificação de maior tolerância de combinações copa/porta-enxerto frente ao HLB poderá contribuir para o avanço no manejo da doença. Neste trabalho avaliou-se o desempenho horticultural de laranjeira ‘Valência’ enxertada em 16 porta-enxertos de citros e a tolerância das combinações ao HLB, com o objetivo de selecionar combinações que tolerem o progresso da enfermidade. O experimento foi instalado em 2011 em Bebedouro-SP, no espaçamento de 6,0 x 2,5 m em regime de sequeiro. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado com 16 tratamentos (porta-enxertos) e 30 repetições. Realizaram-se estudos de análise de sobrevivência feitos através de avaliações de sintomas do HLB. O desempenho horticultural das diferentes combinações copa/porta-enxerto foi analisado por meio de variáveis de crescimento das plantas, produção, eficiência produtiva, qualidade dos frutos e tolerância à seca. Foram avaliadas a intensidade de brotação das plantas para correlacionar com a variável intensidade de plantas com sintomas de HLB. Os resultados mostraram que a produção de frutos e crescimento vegetativo para os porta-enxertos citrange ‘Carrizo’ tetraploide, ‘Cleópatra’ x ‘Christian’ foi equivalente aos porta-enxertos limoeiro ‘Cravo’ e citrumelo ‘Swingle’. O porta-enxerto trifoliata ‘Flying Dragon’ apresentou boa aptidão para o cultivo adensado, por ter proporcionado pouco vigor e maior valor de eficiência produtiva. Os híbridos com parental P. trifoliata conferiram as copas de laranjeira ‘Valência’ produção de frutos de maior qualidade. Os porta-enxertos ‘Sunki’ x ‘Benecke’, tangerineira ‘Sunki e ‘Carrizo’ tetraploide induziram média tolerância à seca inferior à ‘Cravo’ tido como padrão de tolerância. O trifoliata ‘Flying Dragon’ induziu baixa intensidade de brotação, menor incidência da doença e alta proporção acumulativa de sobrevivência. Porta-enxertos menos vigorosos que conferiram menor volume às copas apresentaram menor incidência de HLB, resultando em menor exposição ao vetor da bactéria causadora da doença. A capacidade das plantas enxertadas sobre o trifoliata ‘Flying Dragon’ apresentarem sintomas de HLB tardiamente em relação aos demais porta-enxertos estudados, pode constituir um indicativo de maior capacidade desse material tolerar o progresso da doença. / Brazil is the largest producer of oranges in the world, and the huanglongbing (HLB) is the most important and devastating disease of the world citriculture. It is present in the country, more specifically in the States of São Paulo, Paraná, and Minas Gerais and has been causing severe damage to the citriculture. Until now there are no valid curative measures in HLB control, hence verification of greater tolerance of combinations scion/rootstock front HLB may contribute to advancement in the management of the disease. This work evaluated the horticultural performance of 'Valencia' orange tree grafted on 16 citrus rootstocks and tolerance of combinations to HLB, with the objective of selecting combinations that tolerate the progress of the disease. The experiment was installed in 2011 in Bebedouro-SP, at a spacing of 6.0 x 2.5 m in the rainy season. It has a completely randomized design with 16 treatments (rootstock) and 30 replications. Survival analysis studies were performed using HLB symptom assessments The horticultural performance of the different combinations scion/rootstocks was analyzed using variables of plant growth, production, productive efficiency, fruit quality and drought tolerance. The intensity of sprouting of the plants was evaluated to correlate with the variable intensity of plants with HLB symptoms. The results showed that the superiority found for fruit production and vegetative growth for 'Carrizo' tetraploid, ‘Cleopatra’ x ‘Christian’ rootstocks was equivalent to 'Cravo' and 'Swingle' rootstocks. The rootstock trifoliate ‘Flying Dragon’ showed a good aptitude for dense cultivation, introducing low vigor and higher value production efficiency plants. Hybrids with parental P. trifoliata conferred to 'Valencia' sweet orange scion production of higher quality fruits. The ‘Sunki’ x ‘Benecke’, ‘Sunki’ and 'Carrizo tretraploid' rootstocks induced medium tolerance to drought, getting behind only 'Cravo' considered as a tolerance standard. ‘Flying Dragon’ trifoliate obtained low sprouting intensity, lower incidence of the disease and high cumulative proportion of survival. Less vigorous rootstocks that confer lower crown volume had a lower incidence of HLB, resulting in less exposure to the vector of the disease-causing bacteria. The ability of plants grafted on ‘Flying Dragon’ trifoliata to present late HLB symptoms late compared to the other rootstocks studied, may be an indication of the more significant capacity of this material to tolerate the disease progression. / FAPESP: 2016/17480-3