Les glucocorticoïdes jouent un rôle important dans le développement pulmonaire : différenciation cellulaire, alvéolarisation, induction des composés du surfactant, etc. L'administration de glucocorticoïdes de synthèse à la mère à risque d'accoucher prématurément est utilisée pour accélérer la maturation pulmonaire et réduire le risque de syndrome de détresse respiratoire chez l'enfant. Cette étude vise à déceler la synthèse de glucocorticoïdes actifs par le poumon foetal murin. L'étude en protéine du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) montre une augmentation de la quantité de GR activé dans le poumon foetal murin en présence de progestérone. Un système d'expression de la luciférase sous le contrôle d'éléments de réponse aux glucocorticoïdes a été mis au point. Ce système n'a pas permit de déceler la synthèse de glucocorticoïdes actifs à partir des extraits stéroïdiens des poumons totaux. Cette constatation peut s'expliquer par une conversion rapide des glucocorticoïdes en composés inactifs ou incapables de se lier au récepteur.

La maturité pulmonaire des garçons est retardée par la présence de niveaux plus élevés d'androgènes durant la grossesse. Dans le but d'étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette régulation androgénique, un protocole d'accouplement avec une précision de plus ou moins 30 minutes sur l'âge gestationnel et permettant la détection de la grossesse avant la mi-gestation a été mis au point chez la souris. Aussi, une méthode utilisant la spectroscopie infrarouge pour mesurer la maturité pulmonaire à partir du liquide amniotique fœtal a été élaborée. En plus de rendre disponibles les outils nécessaires à la poursuite du projet de recherche, ces travaux permettront l'étude de l'effet d'un traitement administré à la mi-gestation et portant sur n'importe quel aspect du développement survenant plus tard en gestation. De plus, l'achèvement de la méthode permettra la détermination de façon quantitative de la maturité pulmonaire fœtale individuelle chez la souris. / Male's pulmonary maturity is delayed by the presence of high androgen levels during gestation. To study molecular mechanisms responsible for this androgenic regulation, a mating protocol with a precision of plus or minus 30 minutes on gestational age and early detection of gestation have been set up. In addition, a method using infrared spectroscopy to measure pulmonary maturity with fetal amniotic fluid has been developed. In addition to making available necessary tools for the pursuit of this research project, these results will allow the study of a mid-gestation administrated treatment effect on any developmental aspects occurring later in gestation. Moreover, the method completion will make possible quantitative determination of individual fetal pulmonary maturity in mice.

Le processus de maturation pulmonaire implique entre autres la production d'un composé majoritairement lipidique : le surfactant. Cette étude réalisée du jour de gestation (JG) 15.5 au jour post-natal (PN) 10 a permis d'identifier dans le poumon murin les sites d'expression des apolipoprotéines (apo) A-I, A-Il, C-II, H et de la lipoprotéine lipase (LPL), gènes impliqués dans le métabolisme des lipides. On observe une co-localisation dans les cellules épithéliales des conduits respiratoires au JG 17.5 pour tous les messagers étudiés. Une co-localisation pour les protéines apoA-I, H et LPL est observée dans les capillaires. L'apoC-H est exprimée dans les cellules épithéliales distales tandis que l'apoA-II est retrouvée dans le mesenchyme. En période post-natale, l'expression de l'apoC-II et de la LPL se situe dans les conduits bronchiques et les macrophages. La localisation du site d'expression de ces gènes leur suggère un rôle dans la synthèse du surfactant.

Les séléno-glutathion peroxydases (SeGPx) sont des antioxydants qui présentent un dimorphisme sexuel dans différents tissus de rongeurs et d'humains adultes. Il a été démontré que les hormones sexuelles telles que la testosterone et 1'estradiol modulent l'expression des SeGPx. Les souriceaux peuvent être utilisés comme modèle de prématurité pulmonaire humaine car ils naissent avec des poumons immatures et des niveaux hormonaux relatifs similaires à l'humain. Nous avons découvert chez les souriceaux un dimorphisme sexuel unique favorisant les femelles jusqu'à 5 jours après la naissance dans l'expression d'une SeGPx, la GPx-1. Cette différence sexuelle, si elle s'extrapole chez l'humain, pourrait notamment expliquer la plus grande susceptibilité des garçons à la dysplasie bronchopulmonaire et autres complications respiratoires.

L’estradiol (E2) accélère la maturation pulmonaire et la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase de type 2 (17ßHSD2) inactive les estrogènes et les androgènes. L’expression de la 17ßHSD2 fluctue et culmine dans le poumon foetal murin au jour gestationnel 17,5. Les fluctuations de la 17ßHSD2 pulmonaire pourraient être associées aux niveaux de E2 foetal. La 17ßHSD2 placentaire pourrait alors réguler E2 foetal et maternel. Cette étude établit s’il existe une corrélation entre E2 foetal et la 17βHSD2 pulmonaire et compare les ratios (E2 foetal/ E2 maternel) avec l’expression de la 17βHSD2 placentaire. E2 fut dosé par spectrométrie de masse et l’ARNm de la 17βHSD2 fut mesuré par QPCR. Aucune corrélation entre E2 foetal et la 17ßHSD2 pulmonaire n’existe. Les ratios de E2 ne corrèlent pas avec la 17ßHSD2 placentaire. Ces résultats suggèrent un contrôle local de la 17ßHSD2 dans les poumons foetaux tandis que les ratios E2 pourraient être régulés par la 17βHSD1 placentaire. / Estradiol (E2) exerts a positive effect on fetal lung maturation. The 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (17ßHSD2) inactivates estrogens and androgens. 17ßHSD2 also presents a peak and an inter-litter variation of expression at gestational day 17.5 in the murine fetal lung. The variability of the pulmonary 17ßHSD2 mRNA levels could be explained by variations in fetal E2 levels. The placental 17ßHSD2 could regulate fetal and maternal E2. This study determined if a correlation exists between fetal E2 levels and pulmonary 17βHSD2 mRNA levels. A comparison was also made between E2 ratios (fetal / maternal) and the placental 17βHSD2 mRNA levels. E2 was measured by gas chromatography-mass spectrometry and 17βHSD2 was determined by quantitative PCR. There is no correlation between levels of fetal E2 and pulmonary 17ßHSD2 mRNA. Ratios of E2 levels do not correlate with placental 17ßHSD2 mRNA. These results suggest a local control of 17ßHSD2 mRNA levels in fetal lungs. Ratios of E2 could be regulated by the placental 17βHSD1.

Les enfants prématurés naissent avant que ne soit complété leur développement pulmonaire, ce qui engendre des perturbations importantes de l'architecture pulmonaire normale et des conséquences à long terme telle que la bronchodysplasie pulmonaire. La compréhension des mécanismes menant au développement pulmonaire normal est donc primordiale afin de mieux comprendre les stratégies à adopter devant de telles pathologies. Cette étude a permis d'analyser la distribution temporelle et spatiale de deux gènes impliqués dans le développement pulmonaire murin, FABP4 et tubuline P, dans le but de mieux comprendre leur fonction. Les résultats suggèrent que l'expression de FABP4, une protéine associée au transport lipidique, est localisée principalement aux lipofibroblastes et aux cellules endothéliales, et qu'elle augmente en fin de gestation en lien avec le développement du système du surfactant. Quant à tubuline P, son expression diminue graduellement du stade pseudoglandulaire au stade sacculaire. Son rôle exact demeure peu défini, mais elle est certainement impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires essentielles, étant un important constituant des microtubules.

Les hormones stéroïdiennes comme les androgènes, les estrogènes, les glucocorticoïdes et dans une moindre mesure les progestines, sont des modulateurs reconnus du développement pulmonaire. Plusieurs éléments concernant la régulation de l’action de ces stéroïdes restent encore à être identifiés, surtout lors des stades sacculaire et alvéolaire. Premièrement, nous avons caractérisé l’expression des 17β-hydroxystéroïde déshydrogénases (17β-HSDs) de type 1, 2 et 5, de la 5α-réductase de type 1, de la 3α-HSD et du récepteur des androgènes (AR) dans le poumon murin en développement du jour gestationnel (JG) 19.5 au jour postnatal (PN) 30. Les niveaux de 17β-HSD de type 2 diminuaient dramatiquement à la fin du stade sacculaire alors que l’expression du AR augmentait graduellement de la naissance à l’âge adulte. Le AR fut principalement détecté dans le noyau des cellules épithéliales des voies aériennes et dans certaines cellules des voies respiratoires. Les ARNm de la 17β-HSD de type 2 et le AR colocalisaient durant le stade sacculaire, mais la 17β-HSD de type 2 était absente de l’épithélium des voies aériennes durant le stade alvéolaire. Deuxièmement, les niveaux des androgènes et des estrogènes furent mesurés dans le poumon murin du stade canaliculaire au stade alvéolaire. Les niveaux androgéniques présents dans le poumon étaient significativement différents par rapport à ceux présents dans un tissu de référence. Ces résultats sont compatibles avec la présence d’un métabolisme des androgènes régulé lors du développement pulmonaire. Troisièmement, l’expression de la 20α-HSD et des gènes associés à la voie de synthèse «surrénalienne» des glucocorticoïdes furent caractérisés du JG 15.5 au PN 15. Finalement des expériences de culture d’explants pulmonaires ont démontré qu’au JG 15.5, cette voie de synthèse était capable de produire de la corticostérone à partir d’un substrat de progestérone. L’accumulation de corticostérone n’était cependant observable que dans une sous-population des échantillons prélevés au JG 15.5 et était totalement absente après. Cette observation, la forte expression de la 21-hydroxylase, la présence de fortes activités 20α-HSD et 5α-réductase suggèrent toutes la présence d’une régulation locale de l’action du récepteur des glucocorticoïdes (GR) dans le poumon en développement s’ajoutant à celle détectée pour le AR. / Steroid hormones such as progestogens, estrogens, androgens and glucocorticoids are known modulators of lung development. Several elements concerning the role and regulation of steroid action in the developing lung, especially for the saccular and alveolar stages, remain to be investigated. First, a qPCR analysis of 17β-hydroxysteroid dehydrogenases (17β-HSD) type 1, 2 and 5, of 5α-réductase type 1, of m3α-HSD and of androgen receptor (AR) was performed during the saccular and alveolar stages of mouse lung development. AR expression showed a statistically significant increase during the alveolar stage while levels of 17β-HSD 2 expression decreased at the end of the saccular stage and remained low throughout the alveolar period. The androgen receptor (AR) protein was primarily detected in the nucleus of airway epithelial cells and of a subset of respiratory epithelial cells. 17β-HSD 2 mRNA was co-localized with AR protein during the saccular stage, but was absent from airway epithelium during the alveolar stage. Second, androgen and estrogen levels were measured in the murine developing lung from the canalicular to the alveolar stage. Significant difference of androgen levels between lung and control tissue. This fact added to the nuclear localization of AR is compatible with the presence of a regulated androgen metabolism during lung development. Third, expression of 20α-HSD and of the genes associated with the adrenal glucocorticoid synthesis pathway was characterized in the developing lung, from GD 15.5 to PN 15. Finally, corticosterone synthesis was only observed in a fraction of lung explants from gestation day (GD) 15.5. This observation and strong expression of 21-hydroxylase, of 20α-HSD and of 5α-reductase activities suggests local regulation of GC action. It thus appears that the actions of androgens and of glucocorticoids are both regulated at a pre-receptor level in the developing lung from the canalicular stage until the end of the alveolar stage.

Le syndrome de détresse respiratoire (SDR) est plus fréquent chez les nouveau-nés de sexe masculin que féminin, alors que les androgènes et les glucocorticoïdes sont reconnus pour ralentir et accélérer, respectivement, la maturation pulmonaire. Premièrement, nous avons étudié les différences sexuelles dans le transcriptome pulmonaire fœtal chez la souris par une approche de micropuces d’ADN durant une fenêtre de gestation qui précède et inclut la montée de production du surfactant, qui est asynchrone entre femelles et mâles en défaveur de ces derniers. Quatre-vingt-huit transcrits présentant une différence sexuelle dans leur niveau d’expression aux jours gestationnels (JG) 15.5, 16.5 ou 17.5 ont été identifiés. Ils sont impliqués notamment dans la régulation et le métabolisme hormonal, l’apoptose, la régulation transcriptionnelle et le métabolisme des lipides et sont des candidats pour un rôle dans la maturation pulmonaire et la physiopathologie du SDR. Deuxièmement, l’expression des 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17βHSD) de types 2 et 5, qui sont respectivement impliquées dans l’inactivation et la synthèse des androgènes, et du récepteur des androgènes (AR) a été caractérisée dans des poumons fœtaux humains. Des relations entre les niveaux d’expression et l’âge gestationnel ont été observées. La 17βHSD2 et le AR ont été co-localisés notamment dans l’épithélium, alors que la 17βHSD5 a été localisée dans certaines cellules épithéliales. Le niveau protéique de AR a montré d’importantes différences interindividuelles. Ces résultats supportent l’existence d’un métabolisme local des androgènes et une régulation fine de l’occupation de AR dans les poumons fœtaux mâles et femelles durant la période où une naissance prématurée présente de hauts risques. Troisièmement, l’expression de gènes associés à l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) a été quantifiée et localisée dans des poumons fœtaux murins aux JG 15.5, 16.5 et 17.5. La capacité de la corticolibérine (CRH) et de la corticotropine à stimuler l’expression d’enzymes de synthèse de glucocorticoïdes par le poumon fœtal a aussi été abordée, ainsi que la production de glucocorticoïdes. Différents profils d’expression ont été déterminés, l’incubation d’explants pulmonaires fœtaux en présence de CRH augmenta l’expression de la 21-hydroxylase, alors qu’une production de désoxycorticostérone a été détectée. Les modulations temporelles et spatiales observées suggèrent des rôles dans le développement pulmonaire pour des gènes associés à l’axe HPA. / Respiratory distress syndrome (RDS) is more frequent in male neonates than female neonates. Androgens and glucocorticoids are known to delay and accelerate, respectively, the fetal lung maturation. Firstly, we studied the sex differences in the mouse fetal lung transcriptome during a gestational period that overlaps the surge of surfactant synthesis, which occurs earlier in females than in males. Using DNA microarrays, 88 transcripts showing a sex difference in expression at gestational days (GD) 15.5, 16.5, or 17.5 were identified. Those genes were associated to several functional categories, including hormone metabolism and regulation, apoptosis, transcriptional regulation, and lipid metabolism, and are candidates for roles in lung maturation and in the physiopathology of RDS. Secondly, the expression of 17β-hydroxysteroid dehydrogenases (17βHSD) type 2 and 5, which are respectively involved in androgen inactivation and synthesis, and of the androgen receptor (AR), was characterized in human fetal lungs. Statistically significant relationships between expression levels and gestational age were observed. In particular, 17βHSD2 and AR were co-localized in epithelial cells, while 17βHSD5 was localized in a subset of epithelial cells mostly in conducting zones. AR protein levels showed an important interindividual variability. The obtained results support the presence of a local androgen metabolism and a fine-tuning of AR occupancy in human male and female fetal lungs during a gestational period associated with high-risk premature birth. Thirdly, the expression of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis-related genes was quantified and localized in murine fetal lungs at GD 15.5, 16.5, and 17.5. Also, the capability of corticotropin-releasing hormone (CRH) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) to stimulate the pulmonary expression of enzymes involved in the “adrenal” pathway of glucocorticoid synthesis was addressed, as well as the glucocorticoid production. Several distinct gene expression profiles were established, the incubation of fetal lung explants with CRH led to increased levels of 21-hydroxylase gene expression, whereas deoxycorticosterone accumulation was detected. The observed temporal and spatial modulations suggest roles for HPA axis-related genes in the developing lung.

Le traitement des nouveau-nés prématurés représente un défi de taille en médecine pédiatrique. Plusieurs évidences indiquent que ces enfants ne pourront compléter leur développement alvéolaire. L'importance des facteurs mécaniques en tant que régulateurs de l'alvéolisation est de plus en plus évidente. L'oligoamnios réduit la distension à l'intérieur du poumon, résultant en une hypoplasie pulmonaire alors que l'augmentation de la distension induite par l'occlusion trachéale (OT) foetale stimule le développement pulmonaire de façon significative. L'OT est une technique intéressante pour l'étude du développement pulmonaire, mais son caractère invasif rend souhaitable son remplacement par une approche pharmacologique. Le postulat à la base de nos travaux est qu'une accentuation des forces d'étirements du tissu pulmonaire en fin de gestation accélère le développement pulmonaire selon un patron mimant celui du développement pulmonaire normal et que l'élucidation des mécanismes biomoléculaires impliqués rendra possible la modulation du développement pulmonaire. J'ai participé à l'identification de processus biomoléculaires impliqués dans le développement pulmonaire accéléré par TOT. Je devais ensuite cibler un sentier de signalisation ayant un apport potentiel à la réponse aux changements de tensions intra-luminales et évaluer son rôle fonctionnel en inhibant ou en stimulant son activité in vivo. Nous avons travaillé avec le modèle de souris foetales. L'oligoamnios a été provoqué par ponction utérine à 14,5 jours de gestation et les poumons des foetus ont été récoltés 72 heures plus tard. L'OT a été effectuée chez la souris à 16,5 jours de gestation et les poumons des foetus ont été récoltés 3 ou 24 heures plus tard. Dans un sous-groupe, du fasudil, un inhibiteur des Rho kinases (ROCKs), a été injecté de façon intra-péritonéale à des femelles à 16 jours de gestation. Le facteur nécrosant cytotoxique 1 (CNF1 : cytotoxic m necrotizing factor 1) a été utilisé afin de stimuler le membre A de la famille de gène homologue de Ras (RhoA : Ras homolog gene family, member A), un important régulateur positif de l'activité des ROCKs. Le plasmide contenant CNF1 et la glutathione S-transférase a été inséré et amplifié dans E. coli BL21. Suite à son induction par l'IPTG (isopropyl (3-D-l-thiogalactopyranoside), la protéine de fusion a pu être isolée sur une colonne glutathione sépharose puis injectée dans le liquide amniotique à 16,5 jours de gestation. Les poumons ont été récoltés 24 heures après l'injection. L'expression des ROCKs (ROCK1, ROCK2) et a-actine (a-smooth muscle actin ; a-SMA) a été évaluée par immunobuvardage et le développement pulmonaire a été évalué par la mesure du nombre de générations de saccules alvéolaires. Nous avons démontré au cours des dernières années que l'un des effets les plus importants de l'OT est de favoriser l'expression des gènes du cytosquelette. Nous avons confirmé que l'expression de l'a-actine est accrue très rapidement suite à TOT. De plus, nous avons démontré que l'expression de ROCK2, un important régulateur du cytosquelette d'actine, varie en fonction du niveau de distension intra-luminale pulmonaire. En effet, son expression est diminuée dans le modèle d'oligoamnios alors qu'elle est rapidement augmentée suite à l'OT. L'inhibition de l'activité de ROCK par le fasudil inhibe l'effet bénéfique de l'OT sur le développement pulmonaire. Enfin, la stimulation de RhoA par CNF1 favorise la génération de voies aériennes distales d'une façon similaire à l'OT. En conclusion, la modulation du développement pulmonaire par l'inhibiteur de ROCK2 et de l'activateur de RhoA indique que le sentier RhoA/ROCK joue un rôle critique en tant que mécanosenseur dans le développement pulmonaire foetal.