Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-19T17:18:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6847894 bytes, checksum: fd13826f239b9a952bf3541d2710297c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-19T17:18:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6847894 bytes, checksum: fd13826f239b9a952bf3541d2710297c (MD5) Previous issue date: 2001-10-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A maioria dos genes de resistência (genes R) cIonados codifica proteínas que tém dominios conservados. Estas proteinas sao classificadas em classes ou subclasses de acordo com a presenca ou ausência desses domínios. Domínios do tipo LRR (Leucine rich repeat) e NBS (Nucleotide binding site) são os mais freqüentes em produtos dos genes R de mono e dicotiledôneas. A presença desses domínios conservados permite o uso da técnica de PCR com vistas ao isolamento e a clonagem de sequências análogas a genes de resistência (RGA - ReS/Stance Gene Ana/og), mediante o uso de oligonucleotídeos degenerados específicos para regiões conservadas. Associado a mapeamento genético, essa abordagem pode facilitar a clonagem e caracterização de novos genes R. Visando a clonagem e caracterização do gene Ppr1, que confere resistência a ferrugem em E. grandis, procurou-se neste trabalho identificar RGA’s que cossegregassem com este gene. Seqüências análogas a genes R foram amplificadas a partir do DNA isolado de uma matriz de E. grandis resistente a ferrugem, com o uso de oligonucleotídeos degenerados que aneIam a seqüências que codificam domínios conservados de proteínas de resistência. Os fragmentos amplificados (~6OO pb) foram clonados no vetor pGEMT-Easy, transformados em E. coli e seqüênciados. Utilizando-se como critérios o tamanho, o rendimento e a qualidade do DNA, 13 clones, dentre noventa obtidos, foram selecionados (ML 5, ML 21, ML 23, ML 25, ML 27, ML 28, ML 29, ML 31, ML 32, ML 33, ML 34, ML 35 e ML 38) para seqüenciamento. Os clones foram comparados entre si e com outros genes de resistência já caracterizados, com base nas suas seqüências de aminoácidos deduzidas. A análise com o algoritmo Blastx revelou que os clones ML27 e ML34 são similares ao gene N de Nicotiana glutinose e RPSS de Arabidopis thaliana, respectivamente. Além disso, o clone ML27 também foi similar a um homólogo do gene N presente em Pinus radiata. Os clones ML28, ML21, ML23, ML29 e ML38 não mostraram similaridade significativa com seqüências depositadas em bancos de dados e o clone ML05 possui NBS similar a de um provável transportador ABC de arabidopsis. Embora estes clones tenham revelado vários locos RFLP polimórficos entre progenitores da população estudada, nenhum desses polimorfismos cossegregou com o gene Ppr1. Uma segunda fase do trabalho consistiu no desenvolvimento de marcadores SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) a partir do marcador RAPD AT9917. Para tal, o DNA da matriz G21 (E. grandis) foi amplificado com o oIigonucIeotídeo AT9 e o fragmento de 917pb foi purificado do gel, cIonado em vetor apropriado e multiplicado em E. coli DH5α. A partir da seqüência de nucleotídeos deste fragmento, desenharam-se quatro oligonucIeotídeos no sentido direto e três no sentido reverso. Os oligonucleotídeos foram combinados entre si a fim de identificar um par que gerasse polimorfismo entre o genótipo resistente (G21) e o genótipo suscetível (G38). Não foi possível obter polimorfismo a partir da amplificação, mas após clivagem do produto da PCR com a enzima de restrição Cfo I, obteve-se uma banda de aproximadamente 800 pb que cossegregou com o fenótipo de resistência. Todavia, esta banda não cossegregou com o fenótipo de resistência em outras famílias oriundas do mesmo genitor G21. / The majority of cloned resistance genes (R) codes for proteins which have conserved LRR (Leucine Rich Repeat) and NBS (Nucleotide Binding Site) domains. The presence of these conserved domains allows the use of the specific degenerated primers for these conserved regions and PCR technique to amplify resistance gene analogue sequences (RGAs). Associated to genetic mapping, this approach may facilitate the cloning and characterization of new R genes. Aiming to clone and characterize the Ppr1 gene, which confers resistance to rust in Eucalyptus grandis, this work sought to identify RGAs that would cosegregate with this gene. Degenerated oligonucleotides were used to amplify RGAs from a rust -resistant E. grandis clone G21. The amplified fragments (~6OO bp) were cloned into the vector pGEMT-EASY, transformed into E. coli Using DNA size, yield and quality criteria, 13 clones, among the 90 obtained, were selected (ML 5, ML 21, ML 23, ML 25, ML 27, ML 28, ML 29, ML 31, ML 32, ML 33, ML 34, ML 35 and ML 38) for sequencing. The clones were compared to each other and to other resistance genes already characterized, based on their deduced amino acid sequences. The Blastx searches revelead that clones ML27 and ML34 are similar to the N (Nicotiana glutinosa) and RPS5 (Arabidopsis thaliana) genes, respectively. Besides, clone ML27 was also similar to a homologue of the N gene present in P/nus racfiata. Clones ML28, ML21, ML23, ML29 and ML38 did not show significant similarity with sequences in the Genebank and clone MLo5 has a NBS similar to a putative Arabidopsis ABC transporter. Southern analyses using these clones revealed several polymorphic RFLP loci in the progenitors of the Ppr1 mapping population. However, none of them co-segregated with the Ppr1 gene. The other objective of this work was to develop SCARs (Sequence Characterized Amplified Region) markers from the RAPD AT9 marker. G21 DNA was amplified with the primer AT9 and the 917pb band obtained was gel-purified and cloned into pGEMT-EASY vector. Based on the nucleotide sequence of this fragment were designed four primers that align in the forward and three in the reverse orientation. Several combinations of forward and reverse primers were tested in order to obtain a pair that could amplify the expected fragment of 917 bp and generate polymorphism between the resistant (G21) and susceptible (G38) genotypes, respectively. It was not possible to obtain polymorphism directly from the amplification; however, after cleavage of the PCR product with the restriction enzyme CfoI, a band of approximately 800 bp was obtained, which co-segregated with the resistance phenotype in the mapping population. However, this band did not co-segregate with the resistance phenotype in other families originated from the same G21 progenitor. / Dissertação importada do Alexandria.