Fitoplasmas são organismos procarióticos desprovidos de parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios de floema e patogênicos às plantas. Numerosas doenças associadas a este tipo de agentes patogênicos têm sido frequentemente relatadas em espécies cultivadas e plantas daninhas. No presente estudo, sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, tais como clorose e avermelhamento foliar, redução no tamanho das folhas, diminuição dos órgãos florais, superbrotamento de ramos e declínio da planta, foram observados em pomares de fruteiras de caroço como pessegueiro e nectarineira. Além disto, em campos de couve-flor, plantas daninhas conhecidas como mostarda-do-campo também manifestaram sintomas que pareciam ter sido provocados por fitoplamas, expressados por superbrotamento de ramos finos e redução no tamanho de folhas e flores. Assim, o presente trabalho teve por objetivos detectar, identificar e classificar a nível molecular os possíveis fitoplasmas associados às plantas sintomáticas citadas anteriormente, utilizando as técnicas de PCR, análise de RFLP virtual e o método de classificação on-line denominado de iPhyclassifier. Para tanto, o DNA das amostras das fruteiras de caroço e da erva daninha foi extraído com o auxílio de um kit comercial ou através do protocolo 2X CTAB. A detecção dos fitoplasmas foi conduzida por duplo PCR com os primers universais R16mF2/mR1 e SN910601/SN011119 na primeira reação e com o par R16F2n/R2 na segunda reação. Para a mostarda, a identificação dos fitoplasmas também foi realizada através de duplo PCR com os primers e R16(III)F2/R16(III)R1 específicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII. A aplicação de PCR com primers universais permitiu a detecção consistente desses agentes nos tecidos das plantas sintomáticas de pessegueiro, nectarineira e mostarda-do-campo pela amplificação de um fragmento genômico de 1250 pb, correspondente ao gene 16S rRNA. Para todos os hospedeiros analisados, os produtos amplificados por duplo PCR com os primers universais foram purificados, clonados em Escherichia coli e submetidos ao sequenciamento. A análise de RFLP virtual e iPhyclassifier permitiram classificar os fitoplasmas encontrados em mostarda nos grupos 16SrIII e 16SrVII. Os fitoplasmas detectados na mostarda-do-campo, foram definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrIII-B, 16SrIII-J e 16SrIII-U e 16SrVII-B. Em relação aos fitoplasmas encontrados no pessegueiro e nectarineira, foi possível classificar os fitoplasmas nos grupos 16SrI e 16SrIII, sendo definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrI-B em pessegueiro, e em nectarineira, classificados em 16SrI-B e 16SrIII-J. / Phytoplasmas are prokaryotic organisms devoid of cell wall, obligate intracellular phloem parasites and pathogenic to plants. Numerous diseases associated with this type of pathogen have been frequently reported in cultivated species of plants and weeds. In this present study, symptoms typically induced by phytoplasmas, such a yellowing an reddeling leaves, small leaves and flowers, \"witches\' broom\" appearance on terminal new bud growth, and death in plants, were observed in orchards of stone fruit trees such as peach and nectarines. In addition, in fields of cauliflower, weeds known as mustard-field also exhibited symptoms that appeared to have been caused by phytoplasmas, expressed by thin branches and reduced leaf and flower size. The objective of this present study was to detect, identify and classify at molecular level the phytoplasmas possibly associated with the symptomatic plants. PCR techniques, virtual RFLP analysis and the online method known as iPhyclassifier were used. Total DNA was extracted using a commercial kit or through the CTAB protocol. The detection of phytoplasmas was conducted by nested PCR with the universal primers R16mF2/mR1 and SN910601/SN011119 in the first reaction and R16F2n/R2 pair in the second reaction. For mustard-field, the identification of the phytoplasmas was also performed through nested PCR with the primers R16(III) F2/R16(III) R1, which are specific to detection of 16SrIII group phytoplasmas. The application of PCR with universal primers allowed the consistent detection of these agents in the tissues in symptomatic plants of peach, nectarine and mustard-field by the amplification of a 1250 bp genomic fragment, corresponding to the 16S rRNA gene. For all hosts analyzed, the products amplified by nested PCR with the universal primers were purified, cloned in Escherichia coli and sequenced. The analysis of virtual RFLP and iPhyclassifier allowed to classify the phytoplasmas found in mustard in the 16SrIII and 16SrVII groups. The phytoplasmas detected in mustard-field were definitively classified as representatives of the subgroups 16SrIII-B, 16SrIII-J and 16SrIII-U and 16SrVII-B. The phytoplasmas found in the peach and nectarine were classified within the 16SrI and 16SrIII groups, as representatives of the subgroups 16SrI-B for peach and 16SrI-B and 16SrIII-J for nectarine.

Fitoplasmas são organismos procarióticos desprovidos de parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios de floema e patogênicos às plantas. Numerosas doenças associadas a este tipo de agentes patogênicos têm sido frequentemente relatadas em espécies cultivadas e plantas daninhas. No presente estudo, sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, tais como clorose e avermelhamento foliar, redução no tamanho das folhas, diminuição dos órgãos florais, superbrotamento de ramos e declínio da planta, foram observados em pomares de fruteiras de caroço como pessegueiro e nectarineira. Além disto, em campos de couve-flor, plantas daninhas conhecidas como mostarda-do-campo também manifestaram sintomas que pareciam ter sido provocados por fitoplamas, expressados por superbrotamento de ramos finos e redução no tamanho de folhas e flores. Assim, o presente trabalho teve por objetivos detectar, identificar e classificar a nível molecular os possíveis fitoplasmas associados às plantas sintomáticas citadas anteriormente, utilizando as técnicas de PCR, análise de RFLP virtual e o método de classificação on-line denominado de iPhyclassifier. Para tanto, o DNA das amostras das fruteiras de caroço e da erva daninha foi extraído com o auxílio de um kit comercial ou através do protocolo 2X CTAB. A detecção dos fitoplasmas foi conduzida por duplo PCR com os primers universais R16mF2/mR1 e SN910601/SN011119 na primeira reação e com o par R16F2n/R2 na segunda reação. Para a mostarda, a identificação dos fitoplasmas também foi realizada através de duplo PCR com os primers e R16(III)F2/R16(III)R1 específicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII. A aplicação de PCR com primers universais permitiu a detecção consistente desses agentes nos tecidos das plantas sintomáticas de pessegueiro, nectarineira e mostarda-do-campo pela amplificação de um fragmento genômico de 1250 pb, correspondente ao gene 16S rRNA. Para todos os hospedeiros analisados, os produtos amplificados por duplo PCR com os primers universais foram purificados, clonados em Escherichia coli e submetidos ao sequenciamento. A análise de RFLP virtual e iPhyclassifier permitiram classificar os fitoplasmas encontrados em mostarda nos grupos 16SrIII e 16SrVII. Os fitoplasmas detectados na mostarda-do-campo, foram definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrIII-B, 16SrIII-J e 16SrIII-U e 16SrVII-B. Em relação aos fitoplasmas encontrados no pessegueiro e nectarineira, foi possível classificar os fitoplasmas nos grupos 16SrI e 16SrIII, sendo definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrI-B em pessegueiro, e em nectarineira, classificados em 16SrI-B e 16SrIII-J. / Phytoplasmas are prokaryotic organisms devoid of cell wall, obligate intracellular phloem parasites and pathogenic to plants. Numerous diseases associated with this type of pathogen have been frequently reported in cultivated species of plants and weeds. In this present study, symptoms typically induced by phytoplasmas, such a yellowing an reddeling leaves, small leaves and flowers, \"witches\' broom\" appearance on terminal new bud growth, and death in plants, were observed in orchards of stone fruit trees such as peach and nectarines. In addition, in fields of cauliflower, weeds known as mustard-field also exhibited symptoms that appeared to have been caused by phytoplasmas, expressed by thin branches and reduced leaf and flower size. The objective of this present study was to detect, identify and classify at molecular level the phytoplasmas possibly associated with the symptomatic plants. PCR techniques, virtual RFLP analysis and the online method known as iPhyclassifier were used. Total DNA was extracted using a commercial kit or through the CTAB protocol. The detection of phytoplasmas was conducted by nested PCR with the universal primers R16mF2/mR1 and SN910601/SN011119 in the first reaction and R16F2n/R2 pair in the second reaction. For mustard-field, the identification of the phytoplasmas was also performed through nested PCR with the primers R16(III) F2/R16(III) R1, which are specific to detection of 16SrIII group phytoplasmas. The application of PCR with universal primers allowed the consistent detection of these agents in the tissues in symptomatic plants of peach, nectarine and mustard-field by the amplification of a 1250 bp genomic fragment, corresponding to the 16S rRNA gene. For all hosts analyzed, the products amplified by nested PCR with the universal primers were purified, cloned in Escherichia coli and sequenced. The analysis of virtual RFLP and iPhyclassifier allowed to classify the phytoplasmas found in mustard in the 16SrIII and 16SrVII groups. The phytoplasmas detected in mustard-field were definitively classified as representatives of the subgroups 16SrIII-B, 16SrIII-J and 16SrIII-U and 16SrVII-B. The phytoplasmas found in the peach and nectarine were classified within the 16SrI and 16SrIII groups, as representatives of the subgroups 16SrI-B for peach and 16SrI-B and 16SrIII-J for nectarine.

Os fitoplasmas são organismos procariotos sem parede celular, que habitam as células do floema das plantas e são transmitidos, principalmente, por cigarrinhas sugadoras de floema. Este patógeno é responsável por causar doenças em diversas espécies vegetais, provocando a expressão de diversos sintomas, entre os quais podem ser destacados a redução do tamanho foliar, amarelecimento das folhas, superbrotamento de ramos e enfezamento da planta hospedeira. Entre os anos de 2013 e 2014, plantas de três espécies vegetais com sintomas característicos de infecção causada por fitoplasmas foram observadas no estado de São Paulo. O DNA total foi extraído a partir de plantas de couve-flor com sintomas de nanismo, malformação da inflorescência e necrose dos vasos do floema; de plantas da ornamental conhecida por árvore-da-felicidade com sintomas amarelecimento e redução do limbo foliar; e de plantas de Alho-poró com sintomas de enfezamento. Por meio do teste de PCR conduzido em sua maioria com os primers P1A/16S-SR foi possível detectar fitoplasmas nas três espécies vegetais testadas. Os fragmentos genômicos correspondentes ao 16S rRNA dos fitoplasmas foram sequenciados e identificados. Nas plantas de couve-flor e da árvore-da-felicidade foram identificados fitoplasmas afilados ao grupo 16SrVII-B, através da análise virtual de RFLP, cálculo do coeficientes de similaridade (F) e análise filogenética. Para ambas as espécies, este é o primeiro relato da ocorrência de representantes deste grupo, nas condições brasileiras. Nas plantas de Alho-poró foram identificados fitoplasmas afiliados ao subgrupo 16SrIII-J e ao grupo 16SrXIII, com base na análise dos genes 16S rRNA, SecY e proteína ribossomal, conduzidas através de análise virtual de RFLP, valores de coeficientes de similaridade e análise filogenética. Para o fitoplasma membro do grupo 16SrXIII foram identificadas quatro estirpes, uma delas afiliada ao subgrupo 16SrXIII-E e as demais como prováveis representantes de novos subgrupos. O presente estudo se constitui em uma contribuição ao conhecimento de novos patossistemas envolvendo fitoplasmas, bem como à caracterização molecular de fitoplasmas baseadas em diferentes genes marcadores, atualmente usados para a classificação de representantes deste grupo emergente de agentes causais de doenças de plantas. / The phytoplasmas are prokaryotic organisms without cell walls, which inhabit the phloem cells of plants and are transmitted mainly by leafhoppers sucking the phloem. This pathogen is responsible for causing diseases in various plant species, leading to expression of many symptoms, among which can be highlighted the reduction of leaf size, leaf yellowing, shoots proliferation and stunting of the plant host. Between the years 2013 and 2014, three plant species with characteristic symptoms of infection caused by phytoplasma were observed in São Paulo. Total DNA was extracted from cauliflower plants with symptoms of stunting, malformation of the inflorescence and necrosis of the phloem; ornamental plants known for Ming Aralia with symptoms yellowing and little leaves; and leek plants with symptoms of stunting. Through the PCR test conducted mostly with the primers P1A/16S-SR was possible to detect phytoplasmas in the three species of plants. The genomic fragments corresponding of 16S rRNA gene of the phytoplasma were sequenced and identified. In plants of cauliflower and Ming Aralia were identified phytoplasmas belonging to 16SrVII-B group through virtual RFLP analysis, calculation of similarity coefficients (F) and phylogenetic analysis. For both species, this is the first report of the occurrence of representatives of this group, in Brazilian conditions. In leek plants were identified phytoplasmas affiliated with 16SrIII-J subgroup, and the 16SrXIII group, based on the analysis of the 16S rRNA, SecY and ribosomal protein genes, conducted through virtual analysis of RFLP, similarity coefficient values and phylogenetic analysis. For the phytoplasma member of group 16SrXIII were identified four strains, one affiliated with 16SrXIII-E subgroup and the others as probable representatives of new subgroups. This study constitutes a contribution to knowledge of new pathosystems involving phytoplasmas and the molecular characterization of phytoplasma based on different marker genes, currently used for the classification of representatives of this emerging group of plant pathogens.

Os fitoplasmas são organismos procariotos sem parede celular, que habitam as células do floema das plantas e são transmitidos, principalmente, por cigarrinhas sugadoras de floema. Este patógeno é responsável por causar doenças em diversas espécies vegetais, provocando a expressão de diversos sintomas, entre os quais podem ser destacados a redução do tamanho foliar, amarelecimento das folhas, superbrotamento de ramos e enfezamento da planta hospedeira. Entre os anos de 2013 e 2014, plantas de três espécies vegetais com sintomas característicos de infecção causada por fitoplasmas foram observadas no estado de São Paulo. O DNA total foi extraído a partir de plantas de couve-flor com sintomas de nanismo, malformação da inflorescência e necrose dos vasos do floema; de plantas da ornamental conhecida por árvore-da-felicidade com sintomas amarelecimento e redução do limbo foliar; e de plantas de Alho-poró com sintomas de enfezamento. Por meio do teste de PCR conduzido em sua maioria com os primers P1A/16S-SR foi possível detectar fitoplasmas nas três espécies vegetais testadas. Os fragmentos genômicos correspondentes ao 16S rRNA dos fitoplasmas foram sequenciados e identificados. Nas plantas de couve-flor e da árvore-da-felicidade foram identificados fitoplasmas afilados ao grupo 16SrVII-B, através da análise virtual de RFLP, cálculo do coeficientes de similaridade (F) e análise filogenética. Para ambas as espécies, este é o primeiro relato da ocorrência de representantes deste grupo, nas condições brasileiras. Nas plantas de Alho-poró foram identificados fitoplasmas afiliados ao subgrupo 16SrIII-J e ao grupo 16SrXIII, com base na análise dos genes 16S rRNA, SecY e proteína ribossomal, conduzidas através de análise virtual de RFLP, valores de coeficientes de similaridade e análise filogenética. Para o fitoplasma membro do grupo 16SrXIII foram identificadas quatro estirpes, uma delas afiliada ao subgrupo 16SrXIII-E e as demais como prováveis representantes de novos subgrupos. O presente estudo se constitui em uma contribuição ao conhecimento de novos patossistemas envolvendo fitoplasmas, bem como à caracterização molecular de fitoplasmas baseadas em diferentes genes marcadores, atualmente usados para a classificação de representantes deste grupo emergente de agentes causais de doenças de plantas. / The phytoplasmas are prokaryotic organisms without cell walls, which inhabit the phloem cells of plants and are transmitted mainly by leafhoppers sucking the phloem. This pathogen is responsible for causing diseases in various plant species, leading to expression of many symptoms, among which can be highlighted the reduction of leaf size, leaf yellowing, shoots proliferation and stunting of the plant host. Between the years 2013 and 2014, three plant species with characteristic symptoms of infection caused by phytoplasma were observed in São Paulo. Total DNA was extracted from cauliflower plants with symptoms of stunting, malformation of the inflorescence and necrosis of the phloem; ornamental plants known for Ming Aralia with symptoms yellowing and little leaves; and leek plants with symptoms of stunting. Through the PCR test conducted mostly with the primers P1A/16S-SR was possible to detect phytoplasmas in the three species of plants. The genomic fragments corresponding of 16S rRNA gene of the phytoplasma were sequenced and identified. In plants of cauliflower and Ming Aralia were identified phytoplasmas belonging to 16SrVII-B group through virtual RFLP analysis, calculation of similarity coefficients (F) and phylogenetic analysis. For both species, this is the first report of the occurrence of representatives of this group, in Brazilian conditions. In leek plants were identified phytoplasmas affiliated with 16SrIII-J subgroup, and the 16SrXIII group, based on the analysis of the 16S rRNA, SecY and ribosomal protein genes, conducted through virtual analysis of RFLP, similarity coefficient values and phylogenetic analysis. For the phytoplasma member of group 16SrXIII were identified four strains, one affiliated with 16SrXIII-E subgroup and the others as probable representatives of new subgroups. This study constitutes a contribution to knowledge of new pathosystems involving phytoplasmas and the molecular characterization of phytoplasma based on different marker genes, currently used for the classification of representatives of this emerging group of plant pathogens.