El objetivo general de este trabajo de tesis doctoral fue optimizar un sistema de cultivo para mejorar la calidad y la viabilidad de embriones bovinos in vitro. En primer lugar, evaluamos los efectos de la eliminación de proteína sobre el desarrollo de blastocitos durante un período corto de cultivo individual. La viabilidad del embrión a diferentes plazos fue analizada mediante supervivencia a la criopreservación y recuento diferencial de células embrionarias; porcentajes de gestación; y duración de la gestación, peso y morfometría de los terneros nacidos. Además, se realizó un análisis de expresión génica en blastocistos expandidos de día 7 tanto antes como después de la criopreservación. De este capítulo se puede concluir que el cultivo de embriones individuales durante 24 h en un medio libre de proteína produce menos blastocistos pero aumenta los porcentajes de nacimiento después de la vitrificación y la transferencia a receptoras. A continuación se abordó la evaluación de la viabilidad de los blastocistos expandidos producidos en función de la cinética del embrión y la restricción de proteína durante un periodo corto en cultivo individual. Así, las mórulas y los blastocistos tempranos de día 6 se cultivaron individualmente con y sin proteína durante 24 h. El desarrollo y el contenido de lípidos se analizaron en blastocistos expandidos derivados de mórulas (M-XB) y de blastocistos tempranos (EB-XB). La expresión de genes implicados en el metabolismo lipídico, las respuestas al estrés y la apoptosis se analizaron en M-XB frescos y vitrificados, producidos con y sin proteína. Los índices de gestación, los porcentajes de nacimientos y el peso al nacimiento se registraron después de la transferencia de embriones. Los resultados indican que la cinética embrionaria y la vitrificación impactan en los fenotipos al nacimiento, al menos en el subconjunto de las terneras. Las alteraciones pueden involucrar la proteína exógena y la movilización de las reservas de lípidos. Posteriormente, se investigó si una concentración muy baja de FCS (0.1%) en cultivo desde el día 1 hasta el día 6 podría mejorar los porcentajes de blastocisto temprano (EB) y, a continuación, aumentar los porcentajes de blastocisto expandido (XB) en día 7 después de un cultivo individual sin proteína. La calidad de los embriones producidos se evaluó en términos de supervivencia a la criopreservación, porcentaje de apoptosis, acumulación de lípidos y transferencia a receptoras. Se concluye en este capítulo que la concentración mínima de FCS mejora los porcentajes de EB en el Día 6, permitiendo obtener más XB después de 24h de cultivo individual sin proteína. La calidad de los XB producidos con FCS es similar a los XB producidos con BSA en términos de apoptosis, acumulación de lípidos e índice de gestación. Finalmente, el objetivo en el cuarto capítulo fue cuantificar la proteína total HDGF en el fluido uterino (FU) mediante multiple reaction monitoring (MRM), técnica que permite reconocer la proteína total. Además, analizamos los efectos de rHDGF en etapas embrionarias específicas con embriones bovinos de día 6 cultivados in vitro con y sin proteína (BSA); y sobre la viabilidad de la preñez y los fenotipos de los terneros después de la transferencia de embriones a receptoras. Además, se cuantificó el ARNm de HDGF en células endometriales cocultivadas con un embrión macho o un embrión hembra. De este capítulo se puede concluir que el HDGF total cuantificado por MRM tendió a aumentar en el FU sin embriones, mientras que el sexo del embrión podría regular la expresión endometrial de HDGF. Sin embargo, se debe ser cauteloso con el uso de suplementos macromoleculares específicos en cultivo, ya que pueden contener el GF en estudio, como ocurre con la presencia de HDGF en la BSA comercial, lo que puede alterar los resultados de los experimentos. En última instancia, el uso d / The aim of this thesis was to optimize an embryo culture system in order to improve quality and viability of in vitro bovine embryos. First, we evaluated the effects of protein removal during a short period of individual culture on blastocyst development. Embryo viability was analyzed at different terms through survival to cryopreservation and differential cell counts; pregnancy rates and gestation length, weight and morphometry of calves born. In addition, gene expression analysis was performed on Day-7 expanded blastocysts both before and after cryopreservation. From this work it may be concluded that individual embryo culture for 24 h in a protein-free medium, reduced Day-7 expanded blastocyst rates but improved birth rates after vitrification and transfer to recipients. Next, we evaluated how embryo kinetics and protein restriction during a short step in individual culture would affect the viability of the expanded blastocyst produced. Thus, Day-6 morulae and early blastocysts were cultured individually with and without protein for 24 h. Development and lipid content were analysed in expanded blastocysts derived from morulae (M-XB) and from early blastocysts (EB-XB). Expression of genes involved in lipid metabolism, stress responses and apoptosis was analysed in fresh and vitrified/warmed M-XB produced with and without protein. Pregnancy rates, birth rates and calf birthweight were recorded after transfer of embryos. The results indicate that embryonic kinetics and vitrification impact birth phenotypes, at least in females. Alterations might involve exogenous protein and mobilisation of lipid stocks. Subsequently, we investigated whether very low FCS concentration (0.1%) in culture from Day-1 to Day-6 would improve early blastocyst (EB) rates and, subsequently, increase expanded blastocyst (XB) rates on Day-7 after single culture in protein-free medium. The quality of the produced embryos was evaluated in terms of survival to cryopreservation, apoptosis percentage, lipid accumulation and transfer to recipients. In conclusion, minute FCS concentration improves EB rates on Day-6 leading, after 24h of single culture without protein, to more XBs. The quality of XB produced with FCS compares well with XB produced with BSA in terms of apoptosis, lipid accumulation and pregnancy. Finally, the aim of the last chapter was quantify total HDGF protein in uterine fluid (UF) by multiple reaction monitoring (MRM), and analysed effects of rHDGF on specific embryonic stages with Day-6 bovine embryos cultured in vitro with and without protein (BSA), and on pregnancy viability and calf phenotypes after embryo transfer to recipients. In addition, mRNA abundance of HDGF in endometrial cells co-cultured with one male or one female embryo was quantified. From this chapter it may be concluded that total HDGF quantified by MRM tended to increase in UF without embryos, and that HDGF endometrial expression can be regulated by embryonic sex. Furthermore, rHDGF acts selectively on specific embryonic stages. Nevertheless caution is advised when adding specific macromolecular supplements in culture. It cannot be ruled out that the GF under study can be present in such supplements as verified with HDGF presence in commercial BSA. Small GF traces can alter experimental results. Ultimately, the use of rHDGF is compatible with pregnancy and birth of normal calves. / L'objectiu general d'este treball de tesi doctoral va ser optimitzar un sistema de cultiu per a millorar la qualitat i la viabilitat d'embrions bovins in vitro. En primer lloc, vam avaluar els efectes de l'eliminació de proteïna sobre el desenvolupament de blastocists durant un període curt de cultiu individual. La viabilitat de l'embrió a diferents terminis va ser analitzada per mitjà de la supervivència a la criopreservació i recompte diferencial de cèl¿lules embrionàries; percentatges de gestació; i duració de la gestació, pes i morfometria dels vedells nascuts. A més, es va realitzar un anàlisi d'expressió gènica en blastocists expandits de dia-7 tant abans com després de la criopreservació. D'este capítol es pot concloure que el cultiu d'embrions individuals durant 24 h en un medi lliure de proteïna produeix menys blastocists però augmenta els percentatges de naixement després de la vitrificació i la transferència a receptores. A continuació es va abordar l'avaluació de la viabilitat dels blastocists expandits produïts en funció de la cinètica de l'embrió i la restricció de proteïna durant un període curt en cultiu individual. Així, les mòrules i els blastocists primerencs de dia 6 es van cultivar individualment amb i sense proteïna durant 24 h. El desenvolupament i el contingut de lípids es van analitzar en blastocists expandits derivats de mòrules (M- XB) i de blastocistos primerencs (EB-XB). L'expressió de gens implicats en el metabolisme lipídic, les respostes a l'estrès i l'apoptosi es van analitzar en M-XB frescs i vitrificats, produïts amb i sense proteïna. Els índexs de gestació, els percentatges de naixements i el pes al naixement es van registrar després de la transferència d'embrions. Els resultats indiquen que la cinètica embrionària i la vitrificació impacten en els fenotips al naixement, almenys en el subconjunt de les vedelles. Les alteracions poden involucrar la proteïna exògena i la mobilització de les reserves de lípids. Posteriorment, es va investigar si una concentració molt baixa de FCS (0.1%) en cultiu des del dia 1 fins al dia 6 podria millorar els percentatges de blastocists primerenc (EB) i, a continuació, augmentar els percentatges de blastocists expandits (XB) en dia 7 després d'un cultiu individual sense proteïna. La qualitat dels embrions produïts es va avaluar en termes de supervivència a la criopreservació, percentatge d'apoptosi, acumulació de lípids i transferència a receptores. Es conclou en este capítol que la concentració mínima de FCS millora els percentatges d'EB en el Dia 6, permetent obtindre més XB després de 24h de cultiu individual sense proteïna. La qualitat dels XB produïts amb FCS és semblant als XB produïts amb BSA en termes d'apoptosi, acumulació de lípids e índex de gestació. Finalment, l'objectiu en el quart capítol va ser quantificar la proteïna total HDGF en el fluid uterí(FU) per mitjà de multiple reaction monitoring (MRM), tècnica que permet reconèixer la proteïna total. A més, analitzem els efectes de rHDGF en etapes embrionàries específiques amb embrions bovins de Dia-6 cultivats in vitro amb i sense proteïna (BSA); i sobre la viabilitat del prenyat i els fenotips dels vedells després de la transferència d'embrions a receptores. A més, es va quantificar l'ARNm de HDGF en cèl¿lules endometrials cocultivades amb un embrió mascle o un embrió femella. D'este capítol es pot concloure que el HDGF total quantificat per MRM va tendir a augmentar en l'FU sense embrions, mentre que el sexe de l'embrió podria regular l'expressió endometrial de HDGF. No obstant això, s'ha de ser cautelós amb l'ús de suplements macromoleculars específics en cultiu, ja que poden contindre el GF en estudi, com ocorre amb la presència de HDGF en la BSA comercial, la qual cosa pot alterar els resultats dels experiments. En última instància, l'ús de rHDGF és compatible amb la gestació i el na / Murillo Ríos, AV. (2018). SISTEMA DE CULTIVO PARA MEJORAR LA VIABILIDAD DE EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN VITRO [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111541 / TESIS

[EN] In vitro production (IVP) of embryos has multiple applications, including the development of transgenic / genetically modified animals that are of broad utility in the biomedical field and could reach to be so in agriculture. In this sense, the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with transfected sperm, such as somatic cell nuclear transfer (SCNT) with transfected cells, have proved to be valid strategies to generate animals with stably integrated exogenous DNA, capable of transmitting to their offspring. However, to make it feasible the availability of a large number of IVP embryos it's necessary. Despite the development of IVP systems of pig embryos for these strategies in the last decades, and a high variety of protocols, there are still some critical issues that limit embryonic development and therefore its application on a large scale. The main objective of this thesis has then pursued, optimizing the ICSI and SCNT protocols in order to improve the viability of IVP porcine embryos. The initial approach was to address the study both in vitro maturation (IVM) and oocyte activation within the SCNT frame. To this end, the most efficient electrical activation protocol under our working conditions was selected from among three proposals, and we then studied the effect of serum supplement on IVM medium, noticing that it doesn't increase the development of partenogenetic embryos produced by electrical activation nor of those produced by SCNT. Moreover, and in order to optimize the ICSI technique, different aspects such as Ca2+ concentration in the microinjection medium, sperm pretreatment with Triton X-100 (TX) and the addition of cysteine or caffeine supplements to the in vitro culture (IVC) medium post-ICSI, were studied in order to promote sperm nucleus decondensation and oocyte activation. Noticing that: i) the concentration of Ca2+ did not influence the cleavage rate, or the development of partenogenic embryos from microinjected oocytes without sperm (sham injection); ii) caffeine did not increase either the pronuclear formation neither the subsequent embryo development, in combination with TX sperm pre-treatment it reduced oocyte activation and embryo development rates; iii) the pronuclear formation was not increased by the sperm pre-treatment with TX nor by the cysteine treatment, regardless of the time of the study assessment. / [ES] La producción in vitro (PIV) de embriones goza de múltiples aplicaciones, entre las que cabe destacar la obtención de animales transgénicos/modificados genéticamente que resultan de amplia utilidad en el ámbito biomédico y podrían llegar a resultarlo en el agropecuario. En este sentido, tanto la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) con espermatozoides transfectados, como la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) con células transfectadas, han demostrado ser estrategias válidas para generar animales con ADN exógeno integrado de manera estable, capaces de transmitirlo a su descendencia. Sin embargo, para lograrlo es necesario disponer de un gran número de embriones PIV. A pesar del desarrollo durante las últimas décadas de sistemas de PIV de embriones de porcino para estas estrategias, y la disponibilidad de gran variedad de protocolos, persisten aún ciertos puntos críticos que limitan el desarrollo embrionario y por lo tanto su aplicación a gran escala. El objetivo principal de esta tesis ha perseguido por lo tanto, la optimización de los protocolos de ICSI y SCNT con el fin de mejorar la viabilidad de los embriones PIV de porcino. El planteamiento inicial consistió en abordar el estudio tanto de la maduración in vitro (MIV) como de la activación oocitaria en el marco de la SCNT. Para ello se seleccionó de entre tres propuestas de activación artificial, el protocolo de activación eléctrica (que resultó ser el más eficiente bajo nuestras condiciones de trabajo), y se estudió a continuación el efecto del suplemento de suero en el medio de MIV, constatando que no se incrementaba el desarrollo de embriones partenogenotas producidos mediante activación eléctrica ni de aquellos producidos mediante SCNT. Por otra parte, y con el fin de optimizar la técnica de ICSI se abordaron diferentes aspectos como la concentración de Ca2+ en el medio de microinyección, el pre-tratamiento espermático con Triton X-100 (TX), así como la adición de suplementos de cafeína o cisteína al medio de cultivo in vitro (CIV) pos-ICSI, con el fin de favorecer la descondensación del núcleo espermático y la activación oocitaria. Observando que: i) la concentración de Ca2+ no influyó en la tasa de división, ni en la de desarrollo de embriones partenogenotas procedentes de oocitos microinyectados sin espermatozoide (sham injection); ii) la cafeína no incrementó la formación pronuclear ni en el desarrollo embrionario posterior, y en combinación con el pre-tratamiento espermático con TX redujo la activación oocitaria y el desarrollo embrionario; iii) la formación pronuclear no se vio incrementada por el pre-tratamiento espermático con TX ni por el tratamiento con cisteína, independientemente del momento de la evaluación estudiado. / [CAT] La producció in vitro (PIV) d'embrions gaudeix de múltiples aplicacions, entre les quals cap assenyalar l'obtenció d'animals transgènics/modificats genèticament que resulten d'àmplia utilitat en el àmbit biomèdic y podrien arribar a ser-ho en el àmbit agropecuari. En aquest sentit, tant la injecció intracitoplasmàtica d'espermatozoïds (ICSI) amb espermatozoïds transfectats, com la transferència nuclear de cèl.lules somàtiques (SCNT) amb cèl.lules transfectades, han demostrat ser estratègies vàlides per a l'obtenció d'animals amb ADN exogen integrat de manera estable, capaços de transmetrela a la seva descendència. No obstant això, per aconseguir-ho és necessari disposar d'un gran nombre d'embrions PIV. Malgrat el desenvolupament durant les últimes dècades de sistemes de PIV d'embrions de porcí per a aquestes estratègies, i la disponibilitat de gran varietat de protocols, persisteixen encara certs punts crítics que limiten el desenvolupament embrionari i per tant la seva aplicació a gran escala. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha perseguit per tant, l'optimització dels protocols d' ICSI i SCNT per tal de millorar la viabilitat dels embrions PIV de porcí. El plantejament inicial va consistir en abordar l'estudi tant de la maduració in vitro (MIV) com de l'activació oocitària en el marc de la SCNT. Per a això es va seleccionar entre tres propostes d'activació artificial, el protocol d'activació elèctrica (que va resultar ser el més eficient sota les nostres condicions de treball), i es va estudiar a continuació l'efecte del suplement de sèrum en el medi de MIV, constatant que no va incrementar el desenvolupament d'embrions partenogenotes produïts mitjançant activació elèctrica ni d'aquells produïts mitjançant SCNT. D'altra banda, i per tal d'optimitzar la tècnica de l'ICSI es van abordar diferents aspectes com la concentració de Ca2 + en el medi de microinjecció, el pretractament espermàtic amb Triton X-100 (TX), així com l'addició de suplements de cafeïna o cisteïna al mitjà de cultiu in vitro (CIV) pos-ICSI, per tal d'afavorir la descondensació del nucli espermàtic i l'activació oocitària. Observant que: i) la concentració de Ca2+ no va influir en la taxa de divisió, ni en la de desenvolupament d'embrions partenogenotes procedents d'oòcits microinjectats sense espermatozoïd (sham injection); ii) la cafeïna no va incrementar la formació pronuclear ni en el desenvolupament embrionari posterior, i en combinació amb el pretractament espermàtic amb TX va reduir l'activació oocitària i el desenvolupament embrionari; iii) la formació pronuclear no es va veure incrementada pel pretractament espermàtic amb TX ni pel tractament amb cisteïna, independentment del moment de l'avaluació estudiat. / García Mengual, ME. (2016). OPTIMIZACIÓN DE LAS ESTRATEGIAS REPRODUCTIVAS DE MICROMANIPULACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61448 / TESIS