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L’histone désacétylase HDAC1 influence la réponse à des stress métaboliques dans les cellules épithéliales intestinales

Gonneaud, Alexis January 2014 (has links)
Introduction : Les histones désacétylases (HDAC) catalysent le retrait d’un groupement acétyl de résidus lysine. Leurs substrats comprennent les histones et des facteurs de transcription comme NF-κB p65 ou des kinases comme AMPK. Les HDACs contrôlent la prolifération, la mort et la différenciation cellulaires. Des propriétés anti-inflammatoires et anti-tumorales ont été attribuées à des inhibiteurs contre les HDAC, notamment dans les cellules épithéliales intestinales (CEI). Nous avons montré que la perte de HDAC1 entraîne une diminution de la croissance et cela, sans augmentation significative des inhibiteurs du cycle cellulaire comme p21 ou p27 (Moore-Gagné, 2012). J’ai alors hypothétisé que l’absence de HDAC1 pouvait mener à des défauts dans les voies de synthèse ou de production d’énergie. Je me suis donc intéressé à l’étude des voies métaboliques qui participent notamment à la production d’acétyl-CoA, le principal donneur de groupement acétyl, groupement nécessaire pour l’acétylation des histones. Des études récentes ont démontré que les voies métaboliques, en modulant les niveaux d’acétyl-CoA, altèrent les patrons d’acétylation. J’ai donc voulu déterminer le rôle de HDAC1 dans la transmission de stress métaboliques dans les CEI. Méthodes : L’expression de HDAC1 a été réduite dans les cellules de cryptes intestinales de rat (IEC-6) par infection lentivirale de shARN contre HDAC1. Les cellules ont été cultivées avec ou sans glucose et sérum, avec plusieurs métabolites du cycle de Krebs, dont l’acétate, le citrate, le fumarate ou avec le peroxyde d’hydrogène pour induire un stress oxydant. L’acétylation des histones H3 et H4 ont été déterminées par immunobuvardage avec des anticorps contre des histones acétylées. La viabilité cellulaire a été mesurée par essai MTT, et les radicaux libres par oxydation du DCFDA. Les protéines différemment exprimées ont été identifiées par incorporation d’isotopes plus lourds d’acides aminés, suivi de spectrométrie de masse (SILAC) et analysé informatiquement (logiciel MaxQuant). Les cibles repérées ont été analysées par RT-PCR semi-quantitatif et par immunobuvardage. Les niveaux de régulateurs métaboliques tels que l’AMPK ou l’acétyl-CoA carboxylase (ACC) ont été déterminés par immunobuvardage. Le nombre de mitochondries a été observé par fluorescence. Résultats : La perte de HDAC1 augmente globalement l’acétylation des histones. L’absence de glucose et de sérum diminue les niveaux d’acétylation des histones. L’absence de HDAC1 augmente la viabilité cellulaire en présence de fumarate et citrate, et en absence de glucose et sérum. Les cellules shHDAC1 montrent une viabilité accrue après un traitement au peroxyde d’hydrogène. Ceci corrèle avec des niveaux de base diminués de radicaux libres et une surexpression de Sod2, une protéine anti-oxydante. Les résultats ont montré que la perte de HDAC1 comme l’addition de certains métabolites modifient le patron d’acétylation cellulaire, suggérant des perturbations dans les niveaux d’acétyl-CoA. L’analyse SILAC a mis en évidence une altération des voies de signalisation liées à différents processus métaboliques, comme la phosphorylation oxydative et la synthèse des protéines. L’activation constante de l’AMPK suggère que les cellules shHDAC1 sont en restriction calorique permanente, ce qui les rend moins sensibles au stress oxydant et métabolique par rapport aux cellules shCtrl. Les cellules shHDAC1 présentent une augmentation de la quantité de mitochondries, suggérant un défaut de génération d’ATP. Un shunt d’acétyl-CoA vers le noyau serait envisageable. Conclusion : En modifiant les voies métaboliques liées à la production d’acétyl-CoA, la perte de HDAC1 protège les CEI des réactions de stress. HDAC1 contrôle la réponse des CEI à des stress métaboliques.

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