Le contexte de ce projet de thèse était d’approfondir la compréhension du métabolisme de Trypanosoma brucei. Les trypanosomes utilisent différents types de sources de carbone, des hydrates de carbone ainsi que des acides aminés pour alimenter leurs besoins énergétiques et biosynthétiques (conditions imitant réellement l'environnement dans la mouche tse-tse). Les différences de thioesters d'acyl-CoA sont encore inconnues dans ces conditions. Une telle élucidation est essentielle pour comprendre les adaptations métaboliques de l'organisme au cours de son cycle de vie. Cet objectif pourrait être complété par une combinaison d'analyses sensibles de divers groupes de métabolites, de délétions dirigées de gènes ou de régulations négatives. Ces derniers développements intègrent un flux de travail complet d'analyse des flux métaboliques par 13C à l’état-instationnaire. Ce flux de travail combine les méthodes existantes pour la collecte d'échantillons, la métabolomique quantitative basée sur MS et l'analyse isotopique d'acides organiques, d'acides aminés, de composés phosphorylés en plus des thioesters d'acyl Coenzyme A (acyl-CoAs), qui représentent un point central entre le métabolisme central du carbone et les voies anaboliques. Ce flux de travail a d'abord été évalué et validé sur l'organisme modèle Escherichia coli et a fourni de nouvelles idées sur son fonctionnement métabolique. Par la suite, ce flux de travail a ensuite été exploité pour étudier le métabolisme de T. brucei, pour lequel les résultats préliminaires sont décrits et discutés dans cette thèse. / Unusual metabolism of protozoan parasite causing deadly sleeping sickness, Trypanosoma brucei, has been enigmatic for many years. In the past decades, targeted genetic perturbations combined with metabolic analysis have advanced the view on complex compartmentalized metabolism of this organism, but acyl-CoA metabolism on the crossroad between catabolic and anabolic pathways, remains largely uncharacterized. Present work aims at clarifying mitochondrial operation and topology of acyl-CoA network of T. brucei, as well as its interconnections with the rest of metabolism. This has required the development of a complete framework for investigation of acyl-CoA metabolism in T. brucei integrating isotope labeling experiments with metabolite quantification. Sensitive LC-MS method for identification and quantification of acyl-CoAs based on high-resolution mass spectrometry (HRMS) with LTQ-OrbiTrap has been established and applied to investigate acyl-CoA metabolism in the protozoan parasite, as well as in the model organism in systems and synthetic biology, Escherichia coli. Complete workflow from cell cultivation, measurement of extracellular fluxes and analysis of isotopic profile which is result of enzyme-specific incorporation of isotopic tracer allowed modelling of metabolic network and calculation of metabolic fluxes. The entire workflow has been biologically validated and has clarified the link between acyl-CoA and central carbon metabolism in E. coli. The proposed framework has been adapted to T. brucei, for which several sample collection methods have been evaluated thoroughly. It was possible to extract, identify and quantify main acyl-CoA species produced from glucose catabolism. This optimised setup for acyl-CoA analysis will allow collection of data for NMR-based analysis of metabolic end products as well as collection of intracellular metabolites from same sample.