Entre todos os cânceres de pele, o melanoma está entre os menos comuns, mas é responsável pela maior parte das mortes. No caso da doença metastática, não há um tratamento satisfatório capaz de prolongar a vida do paciente. Isso leva à necessidade de novas estratégias e de novos tratamentos que possam reverter a quimiorresistência do tumor. Entre as proteínas que têm seu perfil de expressão modificado no melanoma está a proibitina, cuja expressão aumenta durante a progressão tumoral. Proibitina é uma chaperona mitocondrial pertencente a uma família de proteínas que possuem um resíduo hidrofóbico SPFH, que confere a ela uma capacidade de ancoragem e de organização de espaços em membranas. Além disso, no compartimento nuclear, é um inibidor da família de fatores de transcrição E2F, juntamente com a proteína retinoblastoma (Rb). Em melanomas, proibitina localiza-se no citoplasma, associada à mitocôndria, e no núcleo. No citoplasma, proibitina faz parte da resposta a diversas drogas, como cisplatina, dacarbazina, temozolamida, vimblastina e tunicamicina pode estar relacionado com o aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), já que essas drogas podem de alguma forma induzir ROS intracelular. O aumento de expressão de proibitina, nesse contexto, poderia fazer parte de uma resposta protetora da mitocôndria, o que em última análise protegeria a célula contra a morte celular, já que a inibição de proibitina sensibiliza a célula ao tratamento com cisplatina ou tunicamicina. Além disso, o estresse provocado pela privação de soro fetal bovino em linhagens de melanoma leva ao aumento de expressão de proibitina e é acompanhado pela indução de ROS. No núcleo, proibitina esta colocalizada com MCM5 e MCM7, mas não MCM2. A inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de metaloproteinases de matriz extracelular, não só em melanomas, mas também em linhagens de câncer de mama e de câncer de pulmão. Ainda, proibitina parece estar relacionada com o fenômeno da transição epitélio mesênquima, já que a inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de marcadores mesenquimais como N-caderina e vimentina e a perda de expressão de marcadores epiteliais, como a E-caderina. Outras funções controladas por E2F1 que proibitina pode estar modulando são a capacidade de E2F1 induzir reparo de DNA devido a lesões causadas por radiação UVB e a indução de senescência. A inibição de proibitina em linhagem de câncer de pulmão protegeu a célula contra o dano genotóxico causado pela radiação UVB, pelo aumento da proteína de reparo de DNA Gadd45a, que é induzida por E2F1. Ainda, a inibição de proibitina diminuiu a quantidade de células senescência induzida por adriamicina em linhagens de melanoma. Ainda, a expressão de proibitina responde a fatores do microambiente tumoral como TGF?, IL4 e LPS juntamente com INF? e, além disso, têm sua expressão diminuída durante a maturação de macrófagos. Esses resultados mostram que proibitina pode atuar protegendo o tumor ou bloqueando vias importantes para seu desenvolvimento, dependendo da sua compartimentalização subcelular / Among all skin cancers, melanoma is the least common, but is responsible for most deaths. In metastatic disease, no satisfactory treatment can prolong the patient\'s life. This leads to the need for new strategies and new treatments that may reverse tumor chemoresistance. Among proteins that have their expression profile altered in melanoma is prohibitin whose expression increases during tumor progression. Prohibitin is a mitochondrial chaperone belonging to a family of proteins which possess a hydrophobic residue SPFH, which gives it a capacity for anchorage and organization in membrane regions. Furthermore, in the nuclear compartment, prohibitin is an inhibitor of the E2F transcription factor family, together with the retinoblastoma protein (Rb). In melanomas, prohibitin is located in the cytoplasm, associated to the mitochondria, and inside the nucleus. In the cytoplasm, prohibitin is part of the response to various drugs such as cisplatin, dacarbazine, temozolomide, vinblastine and tunicamycin and may be associated with increased reactive oxygen species (ROS), since these drugs can somehow induce intracellular ROS. Prohibitin overxpression in this context could be part of a protective response of the mitochondria, which ultimately protect cells against death, as prohibitin inhibition sensitizes cells to cisplatin or tunicamycin treatment. Moreover, the stress caused by deprivation of fetal bovine serum in melanoma cell lines leads to prohibitin overexpression and is accompanied by ROS induction. In the nucleus, prohibitin is colocalized to MCM5 and MCM7, but not to MCM2. Inhibition of prohibitin leads to increased expression of matrix metalloproteinases, not only on melanomas but also on breast cancer and lung cancer cell lines. Further, prohibitin appears to be related to the phenomenon of epithelial mesenchymal transition, since prohibitin inhibition leads to increased expression of mesenchymal markers such as N-cadherin and vimentin and loss of expression of epithelial markers, such as E-cadherin. Other functions controlled by E2F1 that are modulated by prohibitin include be the ability of E2F1 to induce DNA repair against UVB radiation and the induction of cellular senescence. Inhibition of prohibitin in lung cancer cell line protected against genotoxic damage caused by UVB radiation, due to DNA repair protein Gadd45a overexpression, which is induced by E2F1. Also, prohibitin inhibition decreased the amount of cell senescence induced by adriamycin in melanoma cell line. Further, prohibitin expression is triggered by tumor microenvironmental factors such as TGF?, IL4, and LPS together with INF? and, in addition, prohibitin expression decreases during macrophages maturation. These results show that prohibitin may act protecting the tumor or blocking pathways important for its development, depending on its subcellular compartment distribution

O melanoma cutâneo é um tipo de tumor formado a partir dos melanócitos, células de origem neuroectodérmica que habitam a epiderme, sendo responsáveis por sua pigmentação. Embora este tumor seja o tipo menos frequente de câncer de pele, ele está associado com altas taxas de mortalidade, principalmente devido a seu comportamento agressivo (alta capacidade metastática) e quimiorresistência aos tratamentos (quimioterapia e radioterapia). Os processos da quimiorresistência em melanoma ainda não são totalmente conhecidos. Estudos prévios de nosso grupo evidenciaram que a expressão da proteína Proibitina (PHB) encontra-se aumentada em células de melanoma frente à exposição a certos quimioterápicos, executando sua função de molécula anti-apoptótica, quando localizada no citoplasma, e/ou supressora tumoral quando no núcleo. Adicionalmente, foi visto que a repressão de PHB sensibiliza as células de melanoma, enquanto a sua superexpressão protege da morte celular induzida por cisplatina. Além disso, estudos de associação genótipo-fenótipo revelaram que o alelo menos frequente/raro do SNP rs6917 (C1703T) na região 3\'UTR do gene da PHB foi associado com o risco aumentado de desenvolvimento do melanoma. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar o envolvimento do SNP rs6917 da 3\'UTR do gene PHB em linhagens de melanoma humano e sua resposta celular frente ao tratamento com agentes quimioterápicos indutores de estresse celular como temozolomida, cisplatina e vemurafenib. Para avaliar a contribuição do polimorfismo rs6917 no desenvolvimento de melanoma, foi desenvolvido um estudo tipo caso-controle numa população brasileira. O estudo analisou 198 pacientes com melanoma e 200 controles. Em ensaios in vitro as linhagens celulares de melanoma humano SK-Mel 05 e UACC-62 (BRAFV600E mutadas) foram transfectadas com as variantes polimórficas UTR/C e UTR/T clonadas no plasmideo pmirGLO Dual-Luciferase nos sítios de restição NheI/XhoI. A Geneticina (G418) foi utilizada para seleção estável das células, ensaios de western Blot, qRT-PCR e luminiscencia confirmaram a expresão do transgene. As diferentes doses de cisplatina, temozolomida e vemurafenib foram definidas para o tratamento das células. Para avaliar a morte celular foi realizada a técnica de citometria de fluxo após incorporação com iodeto de propidio. Após os tratamentos, foram realizados ensaios clonogênicos e de imunofluorescencia para determinar sobrevivencia celular e localização subcelular da proibitina, respectivamente. Nossos resultados revelaram que variáveis clinicas como a presença de cabelos claros (loiros ou ruivos), mais de 20 pintas, exposição solar intermitente, queimaduras solares na infância e adolescência são fatores de risco para o aparecimento de melanoma. Nos casos, os portadores do alelo T mostraram um risco aumentado em 5,6 vezes para o desenvolvimento de melanoma de crescimento vertical em comparação com os pacientes com genótipo CC. Ensaios in vitro, mostraram que células de melanoma humano superexpressando o alelo raro 3\'UTR/T após tratamento com cisplatina, temozolomida e vemurafenib apresentavam um fenotipo mais proliferativo e clonogênico com menor morte celular quando comparadas com as células 3\'UTR/C e vetor vazio. Ensaios de Western blot e bioluminescência mostraram, respectivamente, um aumento na expressão e atividade do gene da luciferase nas células 3\'UTR/T. Estes resultados mostram que o SNP rs6917 modula a expressão de PHB e que o alelo raro T representa um polimorfismo funcional promovendo a quimiorresistência em melanoma / Melanoma is a type of skin tumor formed from melanocytes, cells of neuroectodermal origin that inhabit the epidermis, being responsible for its pigmentation. Although its low incidence, melanoma is associated with high rates of mortality due to its resistance to chemotherapy. The mechanisms involved in melanoma chemoresistance are not well fully understood yet, therefore, the comprehension of this phenomenon may be useful for the development of new treatment strategies. Previous results from our laboratory showed that Prohibitin (PHB), a protein with diverse functions including regulation of cell cycle progression and apoptosis, was overexpressed in human melanoma cells lines when exposed to high-doses of the chemotherapy drug, cisplatin. PHB knockdown sensitized melanoma cells, meanwhile PHB recombinant overexpression protected melanoma cells to cisplatin-induced cell death. Studies of genotype-phenotype association revealed that the Single Nucleotide Polymorphism rs6917 at the portion 3\'UTR of the PHB gene showed an association with some risk factors for the development of melanoma. The aim of this study was to investigate if the SNP rs6917 affects PHB protein function by modulating cell proliferation and chemoresistance in human melanoma cell lines when exposed to stress inductors agents such as cisplatin, temozolomide and vemurafenib. A hospital-based case-control study was carried out in a Brazilian sample to evaluate the contribution of rs6917 polymorphism in melanoma development. The study comprised 198 melanoma patients and 200 controls. For invitro assays SK-Mel 05 and UACC-62 human melanoma cell lines (both BRAFV600E mutated) were used. The 852bp of PHB-3\'UTR harboring wild-type (3\'UTR/C) or the rare allele (3\'UTR/T) were cloned at pmirGLO Dual-Luciferase plasmid at NheI/XhoI restriction sites and stable cell lines were generated. Geneticin (G418) was used for stable selection, qRT-PCR, Western Blot and luciferase assays confirmed the transgene expression. Different doses of cisplatin, temozolomide and vemurafenib were defined to treat the cells. Cell death was evaluated using flow cytometry after propidium iodide incorporation. Cell survival was assessed by clonogenic assay after cells undergone treatment. Our results revealed that clinical variables like presence of light hair, more than 20 moles, intermintent sun expossure and sunburns at childhood are risk factors for melanoma development. We also showed that T allele carriers have a 5,6 times increased risk to develop vertical growth melanoma in comparison with the CC genotype patients. In vitro assays with transfected melanoma cells, SK-Mel 05 and UACC-62, overexpressing the rare allele 3\'UTR/T showed a more proliferative and clonogenical phenotype and less induced cell death after cisplatin, temozolomide and vemurafenib treatment when compared to cells overexpressing the wild-type allele 3\'UTR/C and empty vector. Westernblot and bioluminiscence assays showed respectively an increase in the expresion and activity of the luciferase gene of the 3\'UTR/T cells in comparison with the 3\'UTR/C and empty vector cells. All together these results showed that the SNP rs6917 modulates the expression of PHB and that the rare allele T represents a functional polymorphism by promoting a chemoresistance phenotype in melanoma

O melanoma cutâneo é um tipo de tumor formado a partir dos melanócitos, células de origem neuroectodérmica que habitam a epiderme, sendo responsáveis por sua pigmentação. Embora este tumor seja o tipo menos frequente de câncer de pele, ele está associado com altas taxas de mortalidade, principalmente devido a seu comportamento agressivo (alta capacidade metastática) e quimiorresistência aos tratamentos (quimioterapia e radioterapia). Os processos da quimiorresistência em melanoma ainda não são totalmente conhecidos. Estudos prévios de nosso grupo evidenciaram que a expressão da proteína Proibitina (PHB) encontra-se aumentada em células de melanoma frente à exposição a certos quimioterápicos, executando sua função de molécula anti-apoptótica, quando localizada no citoplasma, e/ou supressora tumoral quando no núcleo. Adicionalmente, foi visto que a repressão de PHB sensibiliza as células de melanoma, enquanto a sua superexpressão protege da morte celular induzida por cisplatina. Além disso, estudos de associação genótipo-fenótipo revelaram que o alelo menos frequente/raro do SNP rs6917 (C1703T) na região 3\'UTR do gene da PHB foi associado com o risco aumentado de desenvolvimento do melanoma. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar o envolvimento do SNP rs6917 da 3\'UTR do gene PHB em linhagens de melanoma humano e sua resposta celular frente ao tratamento com agentes quimioterápicos indutores de estresse celular como temozolomida, cisplatina e vemurafenib. Para avaliar a contribuição do polimorfismo rs6917 no desenvolvimento de melanoma, foi desenvolvido um estudo tipo caso-controle numa população brasileira. O estudo analisou 198 pacientes com melanoma e 200 controles. Em ensaios in vitro as linhagens celulares de melanoma humano SK-Mel 05 e UACC-62 (BRAFV600E mutadas) foram transfectadas com as variantes polimórficas UTR/C e UTR/T clonadas no plasmideo pmirGLO Dual-Luciferase nos sítios de restição NheI/XhoI. A Geneticina (G418) foi utilizada para seleção estável das células, ensaios de western Blot, qRT-PCR e luminiscencia confirmaram a expresão do transgene. As diferentes doses de cisplatina, temozolomida e vemurafenib foram definidas para o tratamento das células. Para avaliar a morte celular foi realizada a técnica de citometria de fluxo após incorporação com iodeto de propidio. Após os tratamentos, foram realizados ensaios clonogênicos e de imunofluorescencia para determinar sobrevivencia celular e localização subcelular da proibitina, respectivamente. Nossos resultados revelaram que variáveis clinicas como a presença de cabelos claros (loiros ou ruivos), mais de 20 pintas, exposição solar intermitente, queimaduras solares na infância e adolescência são fatores de risco para o aparecimento de melanoma. Nos casos, os portadores do alelo T mostraram um risco aumentado em 5,6 vezes para o desenvolvimento de melanoma de crescimento vertical em comparação com os pacientes com genótipo CC. Ensaios in vitro, mostraram que células de melanoma humano superexpressando o alelo raro 3\'UTR/T após tratamento com cisplatina, temozolomida e vemurafenib apresentavam um fenotipo mais proliferativo e clonogênico com menor morte celular quando comparadas com as células 3\'UTR/C e vetor vazio. Ensaios de Western blot e bioluminescência mostraram, respectivamente, um aumento na expressão e atividade do gene da luciferase nas células 3\'UTR/T. Estes resultados mostram que o SNP rs6917 modula a expressão de PHB e que o alelo raro T representa um polimorfismo funcional promovendo a quimiorresistência em melanoma / Melanoma is a type of skin tumor formed from melanocytes, cells of neuroectodermal origin that inhabit the epidermis, being responsible for its pigmentation. Although its low incidence, melanoma is associated with high rates of mortality due to its resistance to chemotherapy. The mechanisms involved in melanoma chemoresistance are not well fully understood yet, therefore, the comprehension of this phenomenon may be useful for the development of new treatment strategies. Previous results from our laboratory showed that Prohibitin (PHB), a protein with diverse functions including regulation of cell cycle progression and apoptosis, was overexpressed in human melanoma cells lines when exposed to high-doses of the chemotherapy drug, cisplatin. PHB knockdown sensitized melanoma cells, meanwhile PHB recombinant overexpression protected melanoma cells to cisplatin-induced cell death. Studies of genotype-phenotype association revealed that the Single Nucleotide Polymorphism rs6917 at the portion 3\'UTR of the PHB gene showed an association with some risk factors for the development of melanoma. The aim of this study was to investigate if the SNP rs6917 affects PHB protein function by modulating cell proliferation and chemoresistance in human melanoma cell lines when exposed to stress inductors agents such as cisplatin, temozolomide and vemurafenib. A hospital-based case-control study was carried out in a Brazilian sample to evaluate the contribution of rs6917 polymorphism in melanoma development. The study comprised 198 melanoma patients and 200 controls. For invitro assays SK-Mel 05 and UACC-62 human melanoma cell lines (both BRAFV600E mutated) were used. The 852bp of PHB-3\'UTR harboring wild-type (3\'UTR/C) or the rare allele (3\'UTR/T) were cloned at pmirGLO Dual-Luciferase plasmid at NheI/XhoI restriction sites and stable cell lines were generated. Geneticin (G418) was used for stable selection, qRT-PCR, Western Blot and luciferase assays confirmed the transgene expression. Different doses of cisplatin, temozolomide and vemurafenib were defined to treat the cells. Cell death was evaluated using flow cytometry after propidium iodide incorporation. Cell survival was assessed by clonogenic assay after cells undergone treatment. Our results revealed that clinical variables like presence of light hair, more than 20 moles, intermintent sun expossure and sunburns at childhood are risk factors for melanoma development. We also showed that T allele carriers have a 5,6 times increased risk to develop vertical growth melanoma in comparison with the CC genotype patients. In vitro assays with transfected melanoma cells, SK-Mel 05 and UACC-62, overexpressing the rare allele 3\'UTR/T showed a more proliferative and clonogenical phenotype and less induced cell death after cisplatin, temozolomide and vemurafenib treatment when compared to cells overexpressing the wild-type allele 3\'UTR/C and empty vector. Westernblot and bioluminiscence assays showed respectively an increase in the expresion and activity of the luciferase gene of the 3\'UTR/T cells in comparison with the 3\'UTR/C and empty vector cells. All together these results showed that the SNP rs6917 modulates the expression of PHB and that the rare allele T represents a functional polymorphism by promoting a chemoresistance phenotype in melanoma

Entre todos os cânceres de pele, o melanoma está entre os menos comuns, mas é responsável pela maior parte das mortes. No caso da doença metastática, não há um tratamento satisfatório capaz de prolongar a vida do paciente. Isso leva à necessidade de novas estratégias e de novos tratamentos que possam reverter a quimiorresistência do tumor. Entre as proteínas que têm seu perfil de expressão modificado no melanoma está a proibitina, cuja expressão aumenta durante a progressão tumoral. Proibitina é uma chaperona mitocondrial pertencente a uma família de proteínas que possuem um resíduo hidrofóbico SPFH, que confere a ela uma capacidade de ancoragem e de organização de espaços em membranas. Além disso, no compartimento nuclear, é um inibidor da família de fatores de transcrição E2F, juntamente com a proteína retinoblastoma (Rb). Em melanomas, proibitina localiza-se no citoplasma, associada à mitocôndria, e no núcleo. No citoplasma, proibitina faz parte da resposta a diversas drogas, como cisplatina, dacarbazina, temozolamida, vimblastina e tunicamicina pode estar relacionado com o aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), já que essas drogas podem de alguma forma induzir ROS intracelular. O aumento de expressão de proibitina, nesse contexto, poderia fazer parte de uma resposta protetora da mitocôndria, o que em última análise protegeria a célula contra a morte celular, já que a inibição de proibitina sensibiliza a célula ao tratamento com cisplatina ou tunicamicina. Além disso, o estresse provocado pela privação de soro fetal bovino em linhagens de melanoma leva ao aumento de expressão de proibitina e é acompanhado pela indução de ROS. No núcleo, proibitina esta colocalizada com MCM5 e MCM7, mas não MCM2. A inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de metaloproteinases de matriz extracelular, não só em melanomas, mas também em linhagens de câncer de mama e de câncer de pulmão. Ainda, proibitina parece estar relacionada com o fenômeno da transição epitélio mesênquima, já que a inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de marcadores mesenquimais como N-caderina e vimentina e a perda de expressão de marcadores epiteliais, como a E-caderina. Outras funções controladas por E2F1 que proibitina pode estar modulando são a capacidade de E2F1 induzir reparo de DNA devido a lesões causadas por radiação UVB e a indução de senescência. A inibição de proibitina em linhagem de câncer de pulmão protegeu a célula contra o dano genotóxico causado pela radiação UVB, pelo aumento da proteína de reparo de DNA Gadd45a, que é induzida por E2F1. Ainda, a inibição de proibitina diminuiu a quantidade de células senescência induzida por adriamicina em linhagens de melanoma. Ainda, a expressão de proibitina responde a fatores do microambiente tumoral como TGF?, IL4 e LPS juntamente com INF? e, além disso, têm sua expressão diminuída durante a maturação de macrófagos. Esses resultados mostram que proibitina pode atuar protegendo o tumor ou bloqueando vias importantes para seu desenvolvimento, dependendo da sua compartimentalização subcelular / Among all skin cancers, melanoma is the least common, but is responsible for most deaths. In metastatic disease, no satisfactory treatment can prolong the patient\'s life. This leads to the need for new strategies and new treatments that may reverse tumor chemoresistance. Among proteins that have their expression profile altered in melanoma is prohibitin whose expression increases during tumor progression. Prohibitin is a mitochondrial chaperone belonging to a family of proteins which possess a hydrophobic residue SPFH, which gives it a capacity for anchorage and organization in membrane regions. Furthermore, in the nuclear compartment, prohibitin is an inhibitor of the E2F transcription factor family, together with the retinoblastoma protein (Rb). In melanomas, prohibitin is located in the cytoplasm, associated to the mitochondria, and inside the nucleus. In the cytoplasm, prohibitin is part of the response to various drugs such as cisplatin, dacarbazine, temozolomide, vinblastine and tunicamycin and may be associated with increased reactive oxygen species (ROS), since these drugs can somehow induce intracellular ROS. Prohibitin overxpression in this context could be part of a protective response of the mitochondria, which ultimately protect cells against death, as prohibitin inhibition sensitizes cells to cisplatin or tunicamycin treatment. Moreover, the stress caused by deprivation of fetal bovine serum in melanoma cell lines leads to prohibitin overexpression and is accompanied by ROS induction. In the nucleus, prohibitin is colocalized to MCM5 and MCM7, but not to MCM2. Inhibition of prohibitin leads to increased expression of matrix metalloproteinases, not only on melanomas but also on breast cancer and lung cancer cell lines. Further, prohibitin appears to be related to the phenomenon of epithelial mesenchymal transition, since prohibitin inhibition leads to increased expression of mesenchymal markers such as N-cadherin and vimentin and loss of expression of epithelial markers, such as E-cadherin. Other functions controlled by E2F1 that are modulated by prohibitin include be the ability of E2F1 to induce DNA repair against UVB radiation and the induction of cellular senescence. Inhibition of prohibitin in lung cancer cell line protected against genotoxic damage caused by UVB radiation, due to DNA repair protein Gadd45a overexpression, which is induced by E2F1. Also, prohibitin inhibition decreased the amount of cell senescence induced by adriamycin in melanoma cell line. Further, prohibitin expression is triggered by tumor microenvironmental factors such as TGF?, IL4, and LPS together with INF? and, in addition, prohibitin expression decreases during macrophages maturation. These results show that prohibitin may act protecting the tumor or blocking pathways important for its development, depending on its subcellular compartment distribution