Les réarrangements du cytosquelette sont essentiels pour la libération de plaquettes. Les RHO-GTPase, en tant que régulateurs du cytosquelette d'actine, joue un rôle important dans la formation de proplaquettes. Dans plusieurs processus cellulaires, CDC42 joue un rôle opposé à RHO/ROCK, qui régule négativement la formation de proplaquettes. Nous montrons que l'activité CDC42 augmenté pendant la différenciation des mégacaryocytes (MK). L’inhibition chimique via la CASIN aussi que l’utilisation d'une forme constitutionnellement active et d’une dominante négative de CDC42 ont montré que le CDC42 régule positivement la formation de proplaquettes. Ensuite nous avons investigué les effecteurs de CDC42 pour déterminer lequel est impliqués dans la formation de proplaquettes. Nous nous sommes d'abord concentrés sur PAK2, qui récemment chez la souris a été montré être activé par CDC42 dans la formation de proplaquettes. En utilisant des inhibiteurs chimiques et un shRNA contre PAK2, nous avons déterminé que, chez l'homme, PAK2 a un effet marginal sur la différenciation terminal des MKs. Donc nous avons étudié la famille WASP. Nous avons déterminé que N-WASP, mais pas WASP, était impliqué dans la formation de proplaquettes. L’ablation de N-WASP, entraîne une diminution marquée de la formation de proplaquettes pour un défaut dans le système de membrane de démarcation (DMS). Ceci a été associé à l'activation de RHOA, et a une concomitante augmentation de la phosphorylation de MLC2 sur Ser19. L’activation de N-WASP augmente pendant la différenciation MK. L'inhibition de la phosphorylation de N-WASP par deux inhibiteurs de la famille de Src kinase familiale, PP2 et Dasatinib, entraine la diminution de la formation de proplaquettes. Nous concluons que N-WASP, mais pas WASP régule positivement le développement du DMS et la formation de proplaquettes et que les kinases de la famille Src en association avec CDC42 régulent la formation de proplaquettes via N-WASP. / Cytoskeleton rearrangements are essential in platelet release. The RHO small GTPase family, as regulators of the actin cytoskeleton, plays an important function in proplatelet formation. In many cellular processes, CDC42 plays an opposite role to RHO/ROCK, which negatively regulates proplatelet formation. We show that CDC42 activity increased during megakaryocyte (MK) differentiation. Use of a chemical inhibitor CASIN or of an active or a dominant-negative form of CDC42 demonstrated that CDC42 positively regulates proplatelets formation. We determined which CDC42 effectors were involved in proplatelets formation. We first focused on PAK2, which was recently shown in mouse to be activated by CDC42 and regulate proplatelets formation. Using chemical inhibitors and an shRNA against PAK2, we determined that in human, PAK2 only has a marginal effect on terminal MK differentiation. Therefore, we switched our study towards the WASP family. We determined that N-WASP but not WASP was involved in proplatelets formation. N-WASP knock-down, led to a marked decrease in proplatelets formation due a defect in the demarcation membrane system (DMS). This was associated with RHOA activation, and a concomitant augmentation in the phosphorylation of MLC2 on Ser19. N-WASP phosphorylation, a primed form of N-WASP, increased during MK differentiation. Phosphorylation inhibition by two Src family kinase inhibitors, PP2 and Dasatinib, decreased proplatelets formation. We conclude that N-WASP, but not WASP positively regulates the DMS development and proplatelets formation and that the Src family kinases in association with CDC42 regulate proplatelets formation through N-WASP.

Les mégacaryocytes sont les précurseurs cellulaires hautement spécialisés qui produisent des plaquettes via des extensions cytoplasmiques appelées proplaquettes. La formation des proplaquettes exige de profonds changements dans l’organisation du cytosquelette: microtubules et actine. Les formines sont une famille de protéines hautement conservées chez les eucaryotes composées de plusieurs domaines qui régulent le remodelage et la dynamique du cytosquelette d'actine et des microtubules. La plupart des formines sont des effecteurs protéiques des Rho-GTPase. DIAPH1, un membre de la famille des formines, est un homologue chez les mammifères du gène diaphanous de la drosophile qui fonctionne comme un effecteur de la petite GTPase Rho et régule le cytosquelette d'actomyosine ainsi que les microtubules. Il contient le domaine de liaison à Rho (Rho-binding domain) dans la partie amino-terminale et deux régions distinctes d’homologie aux formines, FH1 localisée au centre de la protéine et FH2 dans la partie carboxy-terminale. DIAPH1 co-régule le cytosquelette des microtubules et d'actine à travers respectivement ses régions de FH2 et FH1. DIAPH1 est donc un gène candidat idéal dans toutes les fonctions cellulaires qui exigent une coopération entre cytosquelettes d’actine et de microtubules.L'objectif de ce projet de thèse était d’étudier le rôle de DIAPH1 dans la mégacaryopoïèse. A la fin de la maturation des mégacaryocytes, la formation de proplquettes et la migration sont associées à des modifications importantes de la structure du cytosquelette. Nous avons émis l’hypothèse que grâce à la sa double fonction dans la polymérisation de l'actine et la stabilisation des microtubules, DIAPH1 pourrait jouer un rôle essentiel dans les temps terminaux de la différenciation mégacaryocytaire.Nos résultats ont montré qu’au cours de la différenciation mégacaryocytaire, l’expression de DIAPH1 augmente, alors que celles de DIAPH2 et DIAPH3 diminuent, ce qui suggère que DIAPH1 pourrait jouer un rôle plus important que DIAPH2 et DIAPH3 dans les stades tardifs de la différenciation mégacaryocytaire. Les études en immunomarquage montrent que DIAPH1 co-localise avec l’actine F, la tubuline et la myosine IIa en niveau de la membrane plasmique et des proplaquettes. Nous avons étudié la fonction de DIAPH1 par des stratégies d’invalidation (knockdown) et de surexpression d’une forme active de DIAPH1. Les résultats montrent que DIAPH1 est un effecteur important de Rho, pour réguler négativement la formation des proplaquettes en remodelant le cytosquelette d’actine et les microtubules. Le travail antérieur de notre équipe avait montré que Rho-ROCK régulait aussi négativement la formation des proplaquettes, en inhibant l’activation de la myosine IIa. En inhibant simultanément DIAPH1 et ROCK/myosine, nous avons montré que ces deux voies jouent un rôle additif dans la formation des proplaquettes.Ces résultats suggèrent que la coopération entre les voies DIAPH1 et ROCK/myosine est nécessaire pour la formation de structures cellulaire dépendant de l'actomyosine, telles les fibres de stress et l'anneau contractile en agissant à la fois sur le remodelage du cytosquelette et en assurant un équilibre entre l'actomyosine et microtubules. / Megakaryocytes (MKs) are the highly specialized precursor cells that produce platelets via cytoplasm extensions called proplatelets. Proplatelet formation (PPF) requires profound changes in microtubule and actin organization. Formins are a family of highly conserved eukaryotic proteins with multidomains that govern dynamic remodeling of the actin and microtubule cytoskeletons. Most formins are Rho-GTPase effectors proteins. DIAPH1, a member of the formin family, is a mammalian homolog of Drosophila diaphanous gene that works as an effector of the small GTPase Rho and regulates the actomyosin cytoskeleton as well as microtubules. It contains the Rho-binding domain in the N-terminal and two distinct regions of formin homology, FH1 in the center and FH2 in the C-terminus. DIAPH coordinates microtubules and actin cytoskeleton through its FH2 and FH1 regions respectively, making DIAPH an ideal candidate in cell functions that depend closely on the cooperation between the actin and microtubule cytoskeletons.The objective of the project was to decipher the role of DIAPH1 in megakaryopoiesis. At the end of the MK maturation, PPF and MK migration are associated with profound changes in cytoskeleton organization. Due to its dual function in actin polymerization and microtubule stabilization, DIAPH1 was an obvious candidate to play an essential role in PPF and MK migration.Our results showed that DIAPH1 expression increased during MK differentiation, whereas DIAPH2 and DIAPH3 expression decreased, suggesting that DIAPH1 may play a more important role than DIAPH2 and DIAPH3 in the late stages of MK differentiation. Immunostaining showed that DIAPH1 co-localized with F-actin, tubulin and myosin IIa along the plasma membrane and proplatelet. Using a knockdown strategy with shRNA and expression of an active form of DIAPH1, we showed that DIAPH1 is an important effector of Rho that negatively regulates PPF by remodeling actin and microtubule cytoskeletons. A previous work of our team has shown that Rho-ROCK also negatively regulates in PPF by inhibiting myosin IIa activation. By the double inhibition of the DIAPH1 and the ROCK/Myosin pathway, we showed that DIAPH1 and ROCK played additive roles in the negative regulation of PPF. These observations suggest that the cooperation between DIAPH1 and ROCK is required for the formation of cell structures dependent on actomyosin, such as the stress fibers and the contractile ring. Collectively, these results strongly suggest that cooperation of DIAPH1/microtubules and ROCK/Myosin may regulate PPF by modifying the balance between actomyosin and microtubules.